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目的：观察IL-2+IL-15NK细胞体外大规模培养对于不同细胞亚群的细胞表型、细胞扩增倍数、细胞表面活化受体及肿瘤细胞杀伤活性的影响,并初步探讨其作用机制。在此基础上加入Herceptin,通过比较Herceptin在NK细胞体外大规模培养过程中对于细胞扩增倍数、细胞表型、细胞表面活化受体表达、靶细胞杀伤、细胞因子分泌及粘附等方面的影响,探讨Herceptin在NK细胞体外大规模扩增过程中对于不同细胞亚群生物学特点的影响及具体作用机制。方法：收集2012年2月至2013年3月期间天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科乳腺癌患者外周血30例,用Ficoll法获取PBMC。首先,用方案1(IL-2+IL-15)NK细胞体外扩增方案进行培养。观察培养15d后的细胞扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化。流式细胞术检测细胞免疫表型、细胞表面活化受体的表达。LDH释放法和CD107a检测不同细胞亚群对于HLA匹配或不匹配的靶细胞系的杀伤活性。在此基础之上,分别用2种NK细胞体外大规模扩增方案进行培养：方案1(IL-2+IL-15)和方案2(Herceptin+IL-2+IL-15)。在体外培养过程的第0,5,10,15d分别通过流式细胞仪检测各个细胞亚群表型及细胞表面活化受体的变化。流式细胞仪检测体外培养15d后扩增倍数、NK细胞、CD3+CD56+NKT以及T细胞亚群比例。LDH释放法和CD107a检测不同方案扩增产物以及各个细胞亚群对于K562细胞系及多种靶细胞系(T47D、MDA-MB-231、SKBR3. SKOV3、A549)的杀伤能力和作用机制。活细胞工作站检测扩增产物杀伤不同的靶细胞时,效应细胞与靶细胞之间粘附的情况。Elisa法检测不同方案扩增产物杀伤多种靶细胞系时细胞因子IFN-γ、TNF-α和TGF-β分泌量的变化。结果：在体外扩增15d之后,方案1、2的总细胞扩增倍数分别为37.6±26.31,44.82±6.84；NK细胞的扩增倍数分别为89.60±57.17,102.81±94.06；CD3+CD56+NKT的扩增倍数257.01±149.73,362.74±208.86；T的扩增倍数37.18±16.84,43.20±14.75。方案1(IL-2+IL-15)体外扩增NK细胞时,NK细胞表面活化受体NKp30、NKp44、NKG2D升高,CD16降低具有统计学意义(P<0.05)；CD3+CD56+NKT细胞表面活化受体DNAM-1和NKG2D升高(P<0.05);T细胞表面活化受体变化与CD3+CD56+NKT细胞相似,DNAM-1和NKG2D表达升高(P<0.05)。方案1中总扩增产物对于HLA-A不匹配的靶细胞系杀伤活性显著高于杀伤HLA-A匹配的靶细胞系时的杀伤活性(P<0.05)。方案2中Herceptin加入对于其总细胞扩增倍数以及各细胞亚群扩增倍数的影响无统计学意义,但是可以明显提高扩增产物对于各种靶细胞系的杀伤活性,尤其是对于HLA不匹配但HER2+的靶细胞系的杀伤作用明显(P<0.05)。对于各个细胞亚群的细胞表型和细胞表面活化受体,与方案1相比,方案2中NK细胞表面活化受体NKp44的表达升高[(68.83±12.89)%vs(86.95±7.18)%,P<0.05]。同时,方案2中NK细胞以及CD3+CD56+NKT细胞对于HLA不匹配但是HER2+的靶细胞系的粘附作用明显提高(P<0.05)。方案2中扩增产物杀伤肿瘤细胞时IFN-γ和TNF-α的分泌量增加,TGF-β的分泌降低(P<0.05)。结论：方案1(IL-2+IL-15)不仅具有扩增NK细胞的作用,同时具有扩增CD3+CD56+NKT细胞的作用,具有显著增强的非MHC限制性的抗肿瘤杀伤作用。可以通过提高各细胞亚群表面活化受体的表达,来提高其扩增产物的杀瘤活性。方案2(IL-2+IL-15+Herceptin)在保证总扩增倍数和NK扩增倍数的基础上,提高细胞表面活化受体NKp44的表达,提高扩增产物杀伤各种肿瘤细胞系时效靶细胞之间的粘附作用,以及细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌并降低TGF-β的分泌,从而提高扩增产物的杀瘤活性。