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背景:心脏的发育是一个从原始心管形成到完整四腔室心脏的过程。这个过程受到精密的调控,任何一个环节出现偏差都会导致先天性心脏畸形。目前导致心脏组织结构形成异常的机制研究仍然有限。环状RNAs(circ RNAs)可以通过吸附mi RNA等多种方式参与生物学调控过程,是参与心肌病、肌肉发育等多种生命过程的明星分子。研究发现,circ RNAs参与胚胎发育过程中器官形成、物质代谢等过程。这提示了circ RNAs在心脏发生异常过程中可能发挥作用。但目前circ RNAs在心脏发育过程中作用机制研究较少。Circchr2:40655612-40657444是我们通过收集、分析在线公共数据库中circ RNA测序数据筛选到的,低表达于室间隔缺损流产胎儿心肌组织中、有潜在功能的一条circ RNA。根据其来源区域基因,将其称为circ NCX1。前期的生物信息学分析提示circ NCX1可能通过结合并抑制mi R-133的表达,进而抑制心肌细胞分化,最终导致天性心脏病的发生。结合文献复习,目前为止,国内外尚无有关circ NCX1参与心肌细胞发育组织的机制研究。本研究从心肌细胞发育这一视角,以circ NCX1为研究靶标,阐明其在先天性心脏病发生发展中的作用。研究目的:细胞水平探究circ NCX1对心肌细胞形成的影响,初步研究circ NCX1在心肌细胞形成异常中的机制,为先天性心脏病心肌细胞形成异常机制的进一步研究提供证据。研究方法:1、验证circ NCX1的表达及生物学特征1.1 circ NCX1在小鼠不同组织中的表达丰度以7日龄C57BL/6N新生儿小鼠为研究对象,取其肺、心、肝、脾、肾、脑、视网膜等组织,通过Realtime PCR检测其中circ NCX1的表达水平,分析其在小鼠不同组织中的表达规律。1.2 circ NCX1在PA-1细胞分化过程中的表达规律采用0.9%DMSO诱导分化方案,诱导PA-1细胞分化为心肌样细胞利用Realtime PCR检测circ NCX1在分化过程中不同时间点(第0、3、6、9、14天),阐明其在分化过程中的表达规律2、circ NCX1过表达/沉默对细胞功能的影响2.1 circ NCX1表达沉默对PA-1细胞功能的影响构建circ NCX1表达沉默慢病毒载体,转染PA-1细胞,空载体转染细胞作为对照,检测PA-1细胞增殖活力、凋亡、周期、迁移及分化,评价circ NCX1表达沉默对PA-1功能的影响以及在心肌细胞形成异常中的作用。2.2 circ NCX1过表达对PA-1细胞功能的影响分别构建circ NCX1过表达转染的PA-1细胞,空载体转染细胞作为对照,检测PA-1细胞增殖活力、凋亡、周期、迁移及分化,评价circ NCX1表达沉默对PA-1功能的影响以及在心肌细胞形成异常中的作用。3.circ NCX1与mi R-133相互作用的机制探讨3.1 circ NCX1/mi R-133沉默/过表达对心肌细胞发育的影响:体外构建circ NCX1过表达/沉默表达慢病毒载体,同时构建mi R-133过表达/沉默表达慢病毒载体,包被成高滴度慢病毒,同时设立“过表达circ NCX1+过表达mi R-133”组、“过表达circ NCX1”组、“过表达mi R-133”组、“沉默表达circ NCX1+沉默表达mi R-133”组、“沉默表达circ NCX1”组、“沉默表达mi R-133”组,空载作为对照组,分别转染PA-1细胞,筛选稳定表达细胞株。检测PA-1细胞增殖活力、凋亡、周期、迁移及分化。进一步论证circ NCX1与mi R-133之间的调控关系。3.2论证circ NCX1-mi R-133调控轴是circ NCX1发挥功能的分子机制:(1)RIP实验论证circ NCX1、mi R-133和AGO2结合作用。(2)双荧光素酶报告基因实验论证circ NCX1发挥mi R-133海绵体活性。论证circ NCX1与mi R-133的结合作用。研究结果:1.本研究发现,circ NCX1是异常表达于先天性心脏病心肌组织中,具有潜在功能的一条circ RNA,在新生小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、视网膜等组织中,我们通过Realtime PCR检测到circ NCX1在心、肝、脾、肺、肾、脑、视网膜中存在,且在心肌细胞中含量最高。Circ NCX1在心肌细胞分化过程中是高表达状态。2.Circ NCX1相关的CCK-8、MTT、流式细胞术、RT-PCR等分析结果表明:沉默circ NCX1,细胞活力减低,增殖减弱,促进细胞凋亡,G1/G0期细胞减少,G2期细胞增多,mi RNA-133表达水平增高,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平增高;过表达circ NCX1,细胞活力增高,增殖加强,抑制细胞凋亡,G1/G0期细胞增加,G2期细胞减少,mi RNA-133表达水平减低,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平减低。3.Circ NCX1与mi R-133相互作用的相关CCK-8、MTT、流式细胞术、RT-PCR等分析结果表明:同时过表达circ NCX1与mi R-133,细胞活力减低,增殖减弱,促进细胞凋亡,G1/G0期细胞减少,G2期细胞增多,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平增高;同时沉默circ NCX1与mi R-133,细胞活力增高,增殖加强,抑制细胞凋亡,G1/G0期细胞增加,G2期细胞减少,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平减低。可由此推测出Circ NCX1通过负调控mi R-133,从而影响心肌细胞的分化发育过程。4.RIP和双荧光素酶实验论证circ NCX1与mi R-133的结合作用,进一步论证了心肌细胞分化过程中,由于circ NCX1表达量减少,解除了对mi R-133表达的抑制,进而抑制内源性SRF蛋白的表达,减弱相关转录因子的协同作用,从而抑制心肌细胞分化,最终形成先天性心脏病。结论:Circ NCX1在心肌细胞正常分化过程中表达逐渐增高,在细胞水平沉默circ NCX1,细胞活力减低,增殖减弱,促进细胞凋亡,G1/G0期细胞减少,G2期细胞增多,mi RNA-133表达水平增高,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平增高,同时沉默circ NCX1与mi R-133,细胞活力增高,增殖加强,抑制细胞凋亡,G1/G0期细胞增加,G2期细胞减少,HAND2、GATA4、NKX2.5、MEF2C表达水平减低,提示在心肌细胞异常分化过程中,由于circ NCX1表达量减少,负调控mi R-133,从而抑制心肌细胞分化,最终形成先天性心脏病。Circ NCX1或可成为先天性心脏病的潜在治疗靶点,为先天性心脏病的临床治疗提供新思路。