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动物转基因技术主要应用于动物品种改良、生产珍贵蛋白、建立疾病模型、基因治疗和器官移植等方面。近十年来,转基因技术与体细胞核移植技术的结合使转基因的生产有了突飞猛进的发展。目前人们已获得小鼠、大鼠、猪、牛和羊等多种转基因克隆动物,本实验室也于2006年获得了我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪。确定外源基因的拷贝数和插入位点是后续对外源基因表型研究和功能探讨的前提条件。据此,本实验主要研究了绿色荧光蛋白转基因猪及其子代中外源基因拷贝数和整合位点,并利用Junction-PCR对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性。本实验得到结果如下:1.首先采用了PCR法对转基因猪进行初步鉴定,然后PCR法检测的阳性个体再经Southern Blot法做进一步确定。本次实验两种方法取得了一致的鉴定结果,共获得两只原代转基因猪和七只F1代阳性仔猪。2.本实验以TFRC基因为内参,采用绝对定量PCR法检测外源基因拷贝数。标准曲线为:Log2N (拷贝数) = -0.9354△C t+3.4116 (R2=0.9974, p<0.001),计算得到两只原代转基因猪外源基因拷贝数分别为30.489±1.7696和18.8676±1.3383,七只阳性仔猪外源基因拷贝数分别为7.0141±0.3441、6.859±0.5157、9.8897±1.0931、9.1881±1.2008、3.6708±0.5886、5.7114±0.8494和9.5404±0.8438。3.本实验采用TAIL-PCR和LM-PCR成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,其中TAIL-PCR得到25条特异性条带,而LM-PCR得到12条特异性条带。4.将得到的序列经BLAST比对,共获得TgInS1 (1440bp)、TgInS2 (1263bp)和TgInS3 (1861bp)三个整合位点,其中TgInS1为L1M LINE序列,TgInS2和TgInS3与猪ESTs同源。5.采用整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点克隆的准确性。6.采用整合位点5’上游和3’下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,分析整合位点的纯合性。检测的转基因猪都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子。以上结果表明,本研究成功建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR及LM-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础。