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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)不稳定斑块破裂和继发血栓形成是导致急性心血管事件(如急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、猝死型冠心病以及缺血性中风)发生的病理基础。其中斑块局部的炎症细胞(主要是巨噬细胞和T淋巴细胞)与炎症介质所介导的炎症/免疫反应在斑块破裂及促血栓形成所继发的急性冠脉综合征中起至关重要的作用。 近年来CD40和CD40配体(CD40 ligand,CD40L)在AS发生和斑块稳定性中的作用日益引起人们的重视。CD40是一种膜受体蛋白,几乎可在人AS病变中所有的细胞类型(如巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞)中表达;CD40L主要存在于T细胞及激活的血小板表面。CD40通过与CD40L结合可导致一系列的炎症反应。临床研究发现,与对照组及稳定性心绞痛组相比,不稳定性心绞痛患者血清sCD40水平、T细胞与血小板表面CD40L均显著升高。可溶性的CD40L与女性心血管危险相关。基础平均sCD40浓度明显升高者后继发生了心肌梗死,中风或心血管死亡,而对照组没有心血管疾病。病理研究进一步证实无论早期,还是晚期复杂AS病变中都有CD40和CD40L的表达,尤其在斑块易破裂的肩部及破裂的斑块中更为显著;采用高分辨MRI发现,可溶性的CD40配体水平能够反映粥样硬化斑块的脂质积聚。体外研究发现,CD40L可促进AS相关细胞(如巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞)分泌表达趋化因子、粘附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶及促凝因子。通过CD40能够诱导斑块相关细胞表达基质金属蛋白酶与TF表达参与了诱发急性冠脉事件。CD40参与TF表达,在致AS与血管损伤的炎症反应中增强了斑块的致血栓形成作用。sCD40L反映了高胆固醇血症和促凝状态之间的分子联系,而他汀类药物治疗能够显著降低sCD40L与促凝状态。另外,体内sCD40L与血小板激活标志及促凝状态标志呈正相关,CD40信号可以促进血栓的形成,CD40L可诱导内皮细胞组织因子的分泌表达,形成稳定的血栓。激活的T细胞与血小板CD40L能够激活MMP,从而促进粥样硬化斑块破裂。这些证据俱支持CD40信号触发的炎症反应可诱导斑块破裂及血栓形成。CD40L通过增加内皮反应性氧自由基抑制内皮细胞迁移。通过CD40阻断EC迁移可能严重影响斑块糜烂后内皮的再生,从而导致循环血中CD40L升高患者急性冠脉事件发生的危二壑巴些坐里塑翌遇旦塑堕痘参载述的鲍建与抑制粥祥硬些斑块重构的体外研究.一二l.二押琴险性增加。 他汀类药物与GP 11 b/llla拮抗剂能够分别抑制CD40与CD40L的表达。抑制CD4O不仅限制了小鼠AS的进展〔14,‘5,,还改变了粥样硬化斑块的组成,形成了能够促进斑块稳定的形态。并且早期与延迟的抗CD4OL抗体治疗均能够诱导稳定的斑块形态。CD4O有可能成为预防粥样硬化斑块不稳定与破裂的特殊治疗途径。 通过可溶性的CD4O一工g融合蛋白来阻断CD40与CD4OL间的作用,在小鼠移植物抗宿主疾病的治疗中取得了良好的效果〔‘6」,Nom盯a用腺病毒介导CD4o一工gG也成功抑制了大鼠肝移植后的免疫排斥〔‘7,。但至今未见CD40一工g融合蛋白应用于稳定AS斑块的报道。我们拟从阻断cD4o信号着手,寻找治疗AS斑块这一特殊类型炎症的有效办法。 可溶性CD4O蛋白(soluble CD4O,sCD40)由CD4O的胞外区构成,能够与膜表面CD4O竞争性结合CD40L的功能区域,可阻断膜表面CD40与CD4OL的相互作用。受此启发本研究拟构建可溶性CD4O/I gGIF。融合基因重组腺病毒,感染内皮细胞,表达可溶性CD40,竞争性结合rCD4OL,从而阻断由细胞膜表面CD40所介导的动脉粥样硬化斑块重构。从而达到稳定斑块的目的,从发病机理的角度探讨可溶性CD40稳定斑块的可能性。 本研究通过对承载可溶性CD40/工gGFc融合基因的质粒pCD4O插入片断进行测序,构建并合成引物,采用PCR方法获得目的基因,从而应用亚克隆的方法逐步构建重组穿梭质粒与重组腺病毒基因组质粒,经线性化后以脂质体方法转染293细胞,冻融后获得原代病毒,经过293细胞的扩增,以终点稀释试验的方法检测病毒滴度。得到重组腺病毒滴度达到1.3X10sPFU。通过EL工SA与Western blot七ing方法检测目的蛋白可溶性CD4O表达,通过PCR方法验证目的基因。 本研究以脂质体方法将可溶性CD40/IgGIFc重组pcDNA3.1转染血管内皮细胞ECV一304,通过200 pg/m1G一418抗性筛选转染克隆,或以重组腺病毒按10一100pfu/细胞感染上述细胞,并采用EL工SA与Western blotting方法检测可溶性CD4O表达。研究发现,腺病毒感染的内皮细胞ECV一304表达目的蛋白水平显著高于以重组质粒稳定转染的内皮细胞株。本研究通过流式细胞术的方法,验证了内皮细胞株ECv一304膜表面存在cD4O高表达,从而为可溶性CD4O的功能研究奠定了实验基础。 本实验研究观察了体外可溶性CD4O表达载体阻断CD4OCD4OL结合的抗重构效果。以正常血管内皮细胞为空白对照,并同时设立抗CD4O抗体阴性对照。首先将抗CD4O抗体与正常内皮细胞孵育10分钟,再分别加入重组人CD40L,培养24小时,分别于O,2,6,12,24小时收集上清液,并通过EL工SA方法定量检测可溶性CD4O与基质金属蛋白酶二丝些竺些巴竺