青蒿琥酯通过影响神经酰胺从头合成途径的限速酶SPT抑制肝纤维发生的作用

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目的研究青蒿琥酯对肝星状细胞株LX-2细胞内神经酰胺从头合成途径的限速酶SPT及神经酰胺水平的影响,揭示其促进神经酰胺从头合成的抑制肝纤维发生的作用机制,为青蒿琥酯应用于肝纤维化的临床防治提供实验依据。方法1、以体外培养人源肝星状细胞(HSCs)株LX-2为实验对象,将其分为细胞对照组、青蒿琥酯(Art)给药组、神经酰胺C2(C2-ceramide,C2)给药组、青蒿琥酯与神经酰胺C2合用组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析LX-2细胞的增殖情况;应用高效液相色谱HPLC-FLD法测定LX-2细胞培养上清中神经酰胺C2的水平;采用Western Blot法检测LX-2细胞内凋亡相关蛋白bax、bcl-2及caspase-3的表达水平;应用比色法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,以分析青蒿琥酯及神经酰胺C2对LX-2的细胞毒性;利用酶消化法检测LX-2细胞上清液中的羟脯氨酸(Hyp)含量,评价青蒿琥酯抑制肝纤维发生的作用。2、将LX-2细胞分为细胞对照组、青蒿琥酯给药组、丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂—多球壳菌素(myriocin)给药组、青蒿琥酯与多球壳菌素合用组。Western Blot法检测LX-2细胞内丝氨酸棕榈酰转移酶1(SPTLC1)和2(SPTLC2)的表达水平,并用HPLC-FLD法检测其上清液中神经酰胺C2含量,对青蒿琥酯影响LX-2细胞内的神经酰胺从头合成途径加以证实;同时,分别如上述方法检测LX-2细胞增殖,细胞内bax、bcl-2及caspase-3蛋白表达,上清液中Hyp的含量。结果1、青蒿琥酯提高了LX-2细胞中神经酰胺的水平及其作用:与细胞对照组比较得出,青蒿琥酯可显著抑制LX-2的细胞增殖,且其增殖抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性,差异具有统计学意义;青蒿琥酯给药组细胞上清中神经酰胺含量均明显增加(P<0.05);同时,青蒿琥酯可上调LX-2细胞内凋亡相关蛋白bax与caspase-3的表达,下调bcl-2蛋白的表达,使bax/bcl-2比值增大(P<0.05);青蒿琥酯组LDH活性与对照组比较无显著性差异(P>0.05);青蒿琥酯各剂量作用于LX-2细胞24 h后,细胞上清液中Hyp的含量明显减少,且Hyp含量随着青蒿琥酯剂量的增大而逐渐下降(P<0.05)。C2可抑制LX-2的细胞增殖(P<0.05),且其抑制作用呈剂量依赖性;随着C2浓度的增加,细胞内bax与caspase-3蛋白表达增多,bcl-2蛋白表达减少,使bax/bcl-2比值增大,差异具有显著性意义;但各组间LDH活性的差异均无显著性意义(P>0.05);C2可呈剂量依赖性地显著降低LX-2细胞上清液中的Hyp含量(P<0.05)。2、青蒿琥酯增加了LX-2细胞内丝氨酸棕榈酰转移酶1和2的表达及其作用:与细胞对照组比较得出,15μmol/L多球壳菌素处理LX-2细胞24 h时后细胞呈明显的增殖状态(P<0.05);青蒿琥酯给药组的LX-2细胞中神经酰胺从头合成途径的限速酶SPTLC1和SPTLC2蛋白表达增多,细胞上清液中神经酰胺含量增加,且差异均具有统计学意义;而SPT特异性抑制剂多球壳菌素可减少LX-2细胞表达SPTLC1和SPTLC2蛋白(P<0.05),同时,细胞上清液中神经酰胺的含量也降低(P<0.05);15μmol/L多球壳菌素分别与250、350、450μmol/L青蒿琥酯合用后,可减弱青蒿琥酯对LX-2细胞的增殖抑制作用,而且降低青蒿琥酯上调SPTLC1、SPTLC2蛋白表达及神经酰胺水平的作用(P<0.05);与青蒿琥酯单独用药比较,合用15μmol/L多球壳菌素后可减弱青蒿琥酯上调bax、caspase-3及下调bcl-2蛋白表达的能力,同时降低了青蒿琥酯降低LX-2上清液中羟脯氨酸的作用,差异均有统计学意义。结论1、青蒿琥酯可通过增加神经酰胺从头合成途径的限速酶SPT的表达,提高细胞内神经酰胺的水平。2、青蒿琥酯通过提高LX-2细胞内神经酰胺的含量,一方面呈剂量和时间依赖性地抑制LX-2细胞增殖;另一方面上调了bax与caspase-3蛋白表达,下调bcl-2蛋白表达,从而诱导LX-2细胞凋亡。3、青蒿琥酯通过抑制LX-2细胞增殖并诱导细胞凋亡,抑制了胶原蛋白等的产生,从而发挥了抑制肝纤维发生的作用。
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