研究背景：放射治疗是治疗肿瘤的重要手段之一。在美国每年超过160万个新病人被诊断出患有癌症,将近三分之二的患者需要接受放射治疗。放射治疗的治疗获益已有大量的报道。但是,放射治疗在杀伤肿瘤细胞的同时也有可能造成周围正常组织的损伤,也可因所谓的“旁观者效应”造成正常组织损伤。放射导致的正常组织损伤的过程从开始接受辐射后就开始,但临床组织学不会马上出现明显改变,甚至经过一段时间、几个月或几年也不明显。例如,对于肺组织,照射6周后检测到的病理是轻微的变化,即使在高剂量的情况下,病理也是表现为中度改变。但是到6个月,就出现广泛的纤维化。辐射导致的正常组织损伤根据症状出现的时间通常分为急性、早迟发性反应或晚期后遗症。急性(早期)反应是指照射开始后几天或几周内出现的正常组织损伤。早迟发性反应发生的时间在放射治疗开始后1-6个月内。晚反应指症状出现在辐射照射后几个月到几年。放射治疗可以引起所涉及范围内各种正常组织的损伤,包括皮肤损伤、口腔黏膜损伤、胃肠道损伤、肺损伤,听力毛细胞损伤、脑及神经损伤等。如何减轻放射导致的正常组织损伤,一直是放疗学家的研究热点之一。放射性脑及神经损伤是头颈部肿瘤放疗后常见的严重并发症。在放射治疗后脑部肿瘤生存期大于6个月的患者,90%的患者出现认知功能障碍。认知功能障碍的表现为非文字记忆、空间记忆、注意力及解决问题的能力下降。这些后遗症严重影响了他们的生活质量。放射性脑损伤的具体机制,目前仍没有完全弄清楚,可能与以下因素有关：1、射线对脑组织的直接损伤；2、血管损伤；3、自身免疫反应；4、氧化应激反应产生的自由基损伤。需要更多的研究去揭露放射脑正常组织损伤的具体机制。斑马鱼作为一种与人类高度同源的模式生物,目前也广泛应用于人类的很多疾病的研究,很多疾病模型在斑马鱼上都可以复制。与啮齿动物相比,斑马鱼具有以下优点：(1)产卵量大、发育快速,容易获得足够样本量；(2)、饲养经济,成年鱼体积小,空间占用少,具备高通量筛查的条件；(3)、胚胎透明,易于水体观察,动物产生的应激少,实验结果比较客观等优点。利用斑马鱼进行放射损伤的研究也有报道。有研究报道了用12.5Gy射线对斑马鱼幼鱼进行单次全身照射,可以构建成斑马鱼全身放射性组织损伤模型,并发现细胞周期检测点激酶1可有效抑制放射引起的全身组织损伤。也有研究利用照射斑马鱼幼鱼构建全身放射性损伤模型,并通过发现cdcc94基因可以有效的抑制放射引起的p53升高从而减轻放射损伤。也有研究了报道了X-射线对斑马鱼眼睛发育的影响,并且利用斑马鱼幼鱼模型证实了放射可以导致大量的活性氧簇的产生。但是,斑马鱼放射脑损伤模型在国内外未见报道。正常组织放射损伤的防治方法包括抗炎治疗、抗氧化治疗、胚胎干细胞移植治疗、肾素血管紧张素抑制剂类药物治疗、高压氧治疗等。现在对放射导致的正常组织损伤的防治研究越来越多,但是非常有效的能在临床上广泛应用的还是未见报道。对放射损伤的防护仍需寻找一些有效的药物。丙戊酸钠(VPA)是临床上用于治疗癫痫的药物,并且可以应用于很多疾病的治疗。越来越多的研究报道了丙戊酸钠具有抗氧化应激损伤的作用和具有抗炎功效,在小鼠的缺血再灌注损伤时,研究者发现注射300mg/kg的VPA可以抑制氧化应激和炎症,从而起到保护脑组织的作用。也有不少文献报道丙戊酸钠具有神经保护和提高认知功能的作用,在小鼠发生创伤性脑损伤之后,应用VPA可以起到神经保护的作用,可以提高小鼠的认知能力。但是,VPA在放射脑及神经损伤中是否具有保护作用尚无明确研究。胃癌也是一个严重危害人类健康的疾病,在世界范围内是第四多发的疾病,世界范围内每年将有100多万新发胃癌。报道显示在欧洲,在2012年有140,000新病例诊断为胃癌,而且有107,000个病人因胃癌死亡。胃癌是我国一个比较多发的肿瘤之一,中国肿瘤登记地区的数据报告其发病率在所有肿瘤中是第二位,死亡率在第三位。对于可切除的胃肿瘤,手术是主要的治疗方式,但是手术切除后其预后效果仍非常不理想,需要包括化疗、放疗、放化疗等在内的多学科综合治疗。我们拟利用循证医学的方法探讨比较胃癌术中放疗与未进行术中放疗的胃癌患者的疗效差异,及探讨新兴机器人腹腔镜技术治疗胃癌的优劣性。本研究分四部分进行。第一部分：研究利用斑马鱼建立放射性脑及神经损伤模型的可行性。第二部分：研究丙戊酸钠对脑及神经正常组织的放射损伤保护作用的机制,主要是利用斑马鱼放射脑损伤模型及耳蜗听神经毛细胞进行研究。第三、四部分：用循证医学的观点探讨胃癌的综合治疗的应用,主要包括胃癌术中放疗的优劣性及机器人腹腔镜手术技术治疗胃癌的优劣性。第一章 斑马鱼放射脑损伤模型的建立目的：利用新型模式生物建立斑马鱼放射脑损伤模型,并探讨其相关的放射损伤改变。方法：3-6个月大小的160只成年斑马鱼随机平均分配到2组,一组为正常对照组,一组为照射组,照射组给予单次剂量20Gy的头部照射。利用Tunel染色观察脑组织受照射后6h、24h和72h的凋亡情况；利用实时荧光定量PCR的方法检测斑马鱼脑组织P53、P21、BBC3等基因在照射后6h、24h和72h表达变化；利用实时荧光定量PCR的方法检测斑马鱼脑组织中炎症相关因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1 β)、环氧化酶一2(COX-2)和可诱导型一氧化氮合成酶一2(INOS2)等在照射以后6h、12h、24h和72h的表达变化；利用蛋白免疫印迹的方法检测P53蛋白在照射后72h的表达情况；利用商品试剂盒检测氧化应激相关指标活性氧簇(ROS)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)在照射后6h、12h、24h和72h的变化情况；利用开放场检测实验及探索功能检测实验,观察斑马鱼照射一个月后的行为学改变。统计学分析采用SPSS 19.0软件。两独立样本的t检验应用于两样本均数的比较,多组以上以上的样本均数的比较采用完全随机设计资料的方差分析,方差齐性检验采用Levene’s Test,以P<0.05具有统计学意义。结果：放射导致斑马鱼脑组织出现凋亡细胞增多,照射组的凋亡细胞在6h,24h,72h分别为(62.83±6.37)、(39.33±4.89)和(21.17±3.06)个/视野,正常组的凋亡细胞为(2.00±1.41)个/视野,凋亡细胞最高峰出现在照射后6h,与正常对照组相比具有统计学意义(F==263.793,P<0.001)。放射导致斑马鱼凋亡相关基因P53的表达增多(F=113.815,P<0.001)、P21的表达也增多(F=128.551,p<0.001)、BBC3的表达水平也增多(F=65.483,P<0.001),与正常对照组相比具有显著的统计学意义。放射导致斑马鱼促炎症相关基因TNF-α的表达水平增多(F=25.575,P<0.001)、IL-1 β的表达水平也增多(F=12.012,P=0.002)、COX-2的表达水平也增加(F=19.238,P=-0.001)、INOS2的表达水平也增多(F=-15.026,P=0.001),与正常对照组相比均具有统计学意义。放射导致ROS的产生增多(F=11.067,P<0.001)、并且脂质过氧化物丙二醛MDA的水平也增加(F=104.578,P<0.001),同时降低了GSH的水平(F=-651.864,P<0.001)及SOD的活力(F=67.704,P<0.001)。放射还导致斑马鱼在开放场的检测中出现游动距离减少(正常组versurs照射组=(1865.99±389.22)cm versus (948.05±203.19)cm,t=6.611,p<0.001)、游动速度减少(正常组versurs照射组=(6.22±1.30)cm/s versus (3.17±0.67)cm/s,t=6.606,p<0.001)、运动时间减少(正常组versurs照射组=(257.63±23.51)s versus (219.73±36.60)s,t=2.755,p=0.013)及探索能力的减弱(正常组versurs照射组=(5.84±1.59)min versus(15.15±4.41)min,t=-6.276,p<0.001),与正常对照组相比具有统计学意义。结论：利用成年斑马鱼可以成功复制放射脑损伤模型,其模型与其他动物放射脑损伤模型有类似的发病机制。第二章 丙戊酸钠对脑及神经放射损伤的保护机制研究目的：放射诱导产生的活性氧簇(ROS)对正常组织的损伤起着一个非常重要的作用。我们应用斑马鱼的脑组织和耳蜗听神经细胞(HEI-OC1)研究丙戊酸钠(VPA)在放射脑及神经损伤中的作用。方法：VPA临床上用来治疗癫痫,被报道具有抗氧化损伤的作用。本研究应用来干预放射诱导的斑马鱼损伤及耳蜗毛细胞损伤。观察VPA处理对全身照射后斑马鱼的生存率的影响。在照射后的斑马鱼(体内)和耳蜗毛细胞(HEI-OC1)(体外)中,利用商品试剂盒检测了放射导致的ROS、脂质过氧化物产物之一丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平及超氧化物歧化酶(SOD)的活力。并采用了westernblot及RT-PCR检测抗氧化通路Nrf2/HO-1的蛋白水平及基因水平的变化。利用开放场实验及探索功能检测实验检测了斑马鱼在照射后一个月的行为学改变。毛细胞的活力在单独应用丙VPA或VPA联合照射的情况下都进行了检测。利用RNA干扰处理了耳蜗毛细胞的Nrf2,研究其在缺失Nrf2基因的情况下的VPA的作用机制。实验数据用均数±标准差描述,完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA)用于比较多组样本均数的比较,生存分析采用logRank检验。P<0.05认为具有统计学意义。结果：VPA提高了全身致死剂量照射的斑马鱼的存活率(300mg/kg VPA其存活率为76.67%, 100mg/kg VPA其存活率为56.7%),与照射组相比具有显著的统计学意义(log rank test χ2=70.371 P<0.001).在斑马鱼脑组织中,VPA干预减少了放射诱导的ROS (F=421.159, p<0.001)和MDA (F=1797.790, p<0.001)的产生,提高了GSH的水平(F=-18667.751,P<0.001)及SOD的活力(F=2514.697,P<0.001),与照射组相比具有统计学意义。VPA治疗激活了Nrf2/HO-1通路,增加了Nrf2蛋白的核内转移及提高了HO-1的基因(F=2187.762,P<0.001)和蛋白水平,对放射诱导的正常组织损伤起到保护作用。在缺失Nrf2基因的耳蜗毛细胞中,VPA不能起到放射损伤的保护作用(应用VPA与不应用VPA其细胞活力：(40.09±1.76)％versus(41.14±1.09)％,t=-O.877,P=0.430)).VPA还提高了斑马鱼放射脑损伤之后的游动距离(正常组、照射组与VPA治疗组：(2058.08±551.05)cm versus(973.33±216.70)cm versus(1463.80±201.80)cm, F=23.171,p<0.001)、游动速度((6.86±1.84)cm/s versus(3.24±0.72)cm/s versus(4.88±0.67)cm/s,F=23.171,P<0.001)).提高了探索能力((5.74±1.42) min versus(16.39±4.03)min versus(7.18±1.79)min,F=16.453,p<0.001)。结论：VPA对脑及神经的放射损伤起到保护作用,主要是通过激活Nrf2/HO-1通路起作用的。第三章 胃癌术中放疗的疗效分析目的：胃癌是一个难治性的肿瘤,预后非常差,其治疗需要多学科的综合治疗。胃癌术中放疗的疗效还不非常肯定,本研究主要是统计比较胃癌术中进行放疗(实验组)与未进行放疗(对照组)的疗效分析。方法：通过检索Pubmed, EMBASE和cochranelibrary数据库,纳入关于术中放疗与术中未进行放疗的对胃癌的治疗的效果进行比较的文献,主要研究胃癌的总生存率(OS)和局部控制率在实验组中与对照组中的疗效。检索的文献为的2014年7月以前的发表文献。发表偏倚用倒漏斗图进行评估。结果：在各个分期的胃癌中,实验组与对照组在总生存率上比较未具有明显的统计学意义(Hazard ratio(HR)=0.84,95% confidence interval (CI)=0.67-1.05, P=0.12),实验组有利于提高总生存的趋势。在局部晚期的胃癌(Ⅲ期)以上,实验组显著提高了患者的总生存(HR=0.60,95% CI=0.40-0.89,p=0.01)。实验组还提高了局部控制率(HR=0.40,95% CI=0.26-0.61,.P<0.001)。结论：研究表明术中放疗(实验组)可以提高局部晚期的胃癌(Ⅲ期或以上)的总生存,并且提高了胃癌的局部控制率,与对照组相比具有统计学意义。术中放疗的优点仍需要大规模的临床随机对照实验来研究,从而提高胃癌综合治疗的疗效。第四章 机器人与开放胃切除术对胃癌治疗疗效的比较目的：评估机器人胃切除与开放胃切除治疗胃癌的有效性及安全性。方法：全面搜索了PubMed.EMBASE.Cochrane Library及Web of Knowledge等数据库。对比较胃癌治疗中机器人胃切除术及开放胃切除术的研究进行了评价,同时使用术中及术后的结果来评估手术的安全性及有效性,根据资料的异质性选用固定或随机效应模型进行分析。结果：纳入了4项包含5780例胃癌病人的研究,其中520例(9.00%)采用机器人胃切除术,5260例(91%)采用开放胃切除术,相比开放胃切除术,机器人胃切除术的手术时间更长(加权均数差(WMD)=92.37,95%可信区间(CI): 55.63—129.12,p<0.00001).失血量更少(WMD):-126.08,95％CI:-189.02 —.63.13,P<0.0001),住院时间更短(WMD=-2.87；95％CI:-4.17—-1.56；P<0.0001)。在总术后并发症发生率、切口感染、失血、切除的淋巴结数目、吻合口渗漏及术后死亡率等方面未发现统计学差异。结论：本研究分析的结果提示对于胃癌治疗,机器人胃切除术较开放胃切除术为更佳的替代术式,然而仍需具代表性的、设计精良的、多中心的随机对照试验来进一步评估其安全性、有效性以及远期疗效。