第一章miRNA200家族成员在胆囊腺癌中表达及意义目的：通过对正常胆囊上皮细胞株与胆囊腺癌细胞株GBC-SD之间的差异miRNA表达谱的比较及组织样本进一步验证miRNA200家族成员表达变化,并分析其表达水平与胆囊腺癌临床病理特征的相关性,以期为原发性胆囊癌的侵袭和转移机制提供一定的理论依据。方法：1、使用miRNA芯片检测正常胆囊上皮细胞株与胆囊腺癌细胞株GBC-SD之间miRNA表达谱的变化。2、real-time PCR检测14例胆囊腺癌及其癌旁相对正常新鲜组织中miRNA200b和miRNA141的表达以验证1miRNA芯片的结果。3、锁定核酸原位杂交检测53例原发性胆囊腺癌及其癌旁组织石蜡包埋样本中miRNA200b和miRNA141的表达水平及miRNA在组织中的分布情况,进而分析这两种miRNAs的表达水平与胆囊腺癌临床病理特征之间的关系。结果：1、miRNA芯片结果显示与正常胆囊上皮细胞株相比,GBC-SD细胞株中miRNA表达存在差异的miRNA共有150个,其中有89个miRNAs表达上调,61个miRNAs表达下调。miRNA200家族成员miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141表达均明显下调。2、胆囊腺癌组织中miRNA141(?)miRNA200b的表达明显低于癌旁组织,real-time PCR检测与miRNA芯片结果相比,miRNA141和miRNA200b的变化趋势是一致的。3、锁定核酸原位杂交发现胆囊腺癌组织中miRNA200b和miRNA141的表达明显低于及其癌旁正常组织、慢性胆囊炎组织,且miRNA200b和miRNA141的低表达与肿瘤的周围组织侵犯、局部淋巴结转移和肿瘤TNM分期有显著相关性。结论：：miRNA芯片筛选出正常胆囊上皮细胞株与GBC-SD细胞株中存在差异表达的miRNA共有150个,其中有89个表达上调,61个表达下调。胆囊腺癌组织中miRNA200b和：miRNA141的表达明显低于及其癌旁组织,且miRNA200b和miRNA141的低表达与肿瘤的周围组织侵犯、局部淋巴结转移和肿瘤TNM分期有显著相关性。第二章GBC-SD细胞株中miR200b和niRNA141对TGF-β1诱导的EMT的影响目的：选择niRNA200家族具有代表性的成员miRNA200b和miRNA141作为研究对象,探讨miRNA200家族成员调控胆囊腺癌中TGF-β1诱导EMT发生的机制,为更全面地认识胆囊腺癌的内在分子机制提出了新的思路。方法：1、用10ng/ml的TGF-β1诱导GBC-SD细胞,分别于12h、24h、48h、72h作用时间点观察细胞形态变化,Western blotting检测EMT相关标志物E-cadhern、vimentin、FN蛋白的表达,划痕实验与Transwell细胞体外侵袭迁徙实验观察肿瘤细胞的迁移侵袭能力变化及real-time PCR检测niRNA200b和miRNA141的表达水平变化。2、利用脂质体介导的转染方法,将化学合成的miRNA200b和miRNA141寡核苷酸转染GBC-SD细胞上调miRNA200b和miRNA141的表达,再给予TGF-β1刺激,同时设立转染无关序列的阴性对照组、空白对照和单独TGF-β1刺激组,Western blotting和real-time PCR分别检测EMT相关标志物E-cadherin、vimentin、FN蛋白和mRNA的表达水平,并观察肿瘤细胞的迁徙和侵袭能力变化。结果：1、外源性TGF-β1诱导后GBC-SD细胞形态发生变化,由上皮样细胞表型转变为间质样细胞样表型,且上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平不同程度下调,间质标志物vimentin、FN蛋白表达上调,肿瘤细胞的运动迁徙和侵袭能力明显增加,同时miRNA200b和miRNA141表达水平呈时间依赖性下降。2、过表达miRNA200b和miRNA141后,与TGF-β1刺激组比较,E-cadherin mRNA和蛋白水平明显上升,vimentin、FN mRNA和蛋白水平明显下调,同时GBC-SD细胞运动迁徙和侵袭能力与TGF-β1刺激组比较明显降低。结论：TGF-β1可诱导GBC-SD细胞发生EMT; TGF-β1诱导后miRNA200b和miRNA141表达下调；外源性过表达miRNA200b和miRNA141可抑制GBC-SD细胞中TGF-β1诱导的EMT发生,降低GBC-SD细胞的运动迁徙和侵袭能力。第三章]miRNA200家族成员参与GBC-SD细胞EMT的分子机制研究目的：预测并验证ZEB1和ZEB2是：miRNA200b和miR-141的靶基因,以阐明miRNA200b和miR-141参与调控TGF-β1诱导的GBC-SD细胞EMT的可能机制,为靶向miRNA200家族进而阻止GBC的侵袭和转移提供理论依据。方法：1、Western blotting检测了胆囊腺癌和癌旁组织ZEB1和ZBE2蛋白表达水平,并分析胆囊腺癌组织中miRNA200b和miRNA141与ZEB1和ZEB2表达水平的相关性。2、通过常用软件Targetscan、miRanda对miRNA200b和miRNA141进行生物信息学预测。3、采用双荧光素酶报告基因实验从结构学上对ZEB1和ZEB2进行验证。4、利用脂质体介导的转染方法,将化学合成的niRNA200b和miRNA141寡核苷酸转染GBC-SD细胞上调miRNA200b和miRNA141的表达,再给予TGF-β1刺激,同时设立转染无关序列的阴性对照组、空白对照组和单独TGF-β1刺激组,Western blotting和real-time PCR分别检测ZEB1、ZEB2、E-cadherin蛋白和mRNA的表达水平。结果：1、与癌旁组织比较,胆囊腺癌组织中ZEB1和ZBE2蛋白表达水平显著增加,通过统计学分析发现胆囊腺癌组织中ZEB1和ZBE2蛋白表达水平与miRNA200b和miRNA141的表达水平呈显著负相关。2、生物信息学预测到ZEB1和ZEB2均是miRNA200b和miRNA141的靶基因,其中niRNA141与ZEB13’-UTR有3个互补结合位点,miRNA200b与ZEB13’-UTR有5个互补的结合位点；miRNA141与ZEB23’-UTR有4个互补结合位点,miRNA200b与ZEB23’-UTR有5个互补结合位点。3、双荧光素酶报告基因实验发现与野生型pYr-MirTarget-ZEB1-3U和pYr-MirTarget-ZEB2-3U共转染miRNA200b和miRNA141mimics,使GBC-SD细胞中过表达miRNA200b和miRNA141后,细胞荧光素酶活性比转染无关序列时显著降低。转染突变型pYr-MirTarget-ZEB1-3U-Mut和pYr-MirTarget-ZEB2-3U-Mut载体后细胞荧光素酶活性在过表达miRNA200b和miRNA141组、无关序列组中变化不明显,提示miRNA200b和miRNA141对于突变型表达载体的抑制作用消失。4、与空白对照组相比,TGF-β1诱导刺激后GBC-SD细胞中ZEB1和ZEB2蛋白和mRNA表达水平明显升高,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调。与单纯TGF-β1诱导组比较,转染niRNA200b/miRNA141mimics组中ZEB1和ZEB2蛋白表达水平明显下降,但mRNA表达水平无明显变化,E-cadherin蛋白和mRNA表达下调；而无关序列组中ZEB1、ZEB2和E-cadherin蛋白及mRNA表达水平无明显变化。结论：miRNA200b和miRNA141可抑制ZEB1和ZEB2报告基因的活性,并从功能上进一步验证了ZEB1和ZEB2是miRNA200b和miRNA141的靶基因。miRNA200b和miRNA141通过转录后水平抑制ZEB1和ZEB2的表达,间接上调E-cadherin的表达,抑制胆囊腺癌TGF-β1诱导的EMT发生。图34幅,表12个,参考文献111篇。