背景与目的：非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，手术切除辅以化疗是对其治疗的主要手段。然而多数患者因确诊时已为晚期失去了手术机会，多数接受手术治疗的患者也需辅助化疗，因此，化疗是对其治疗的最主要方式。传统的化疗药物因特异性差、毒副作用大，临床应用受到了很大限制。选择恰当的药物，有的放矢的进行个体化治疗，是肿瘤治疗的发展方向。肿瘤分子靶向药物治疗因特异性好，副作用小，正逐渐成为临床肿瘤个体化疗的主流。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibiter, EGFR-TKI）是目前临床治疗NSCLC应用最广的分子靶向药（gefitinib, erlotinib等），该药通过与EGFR酪氨酸激酶区ATP结合位点结合，抑制该酶的活化和磷酸化，使活化信号不能向下传递，抑制瘤细胞增殖，启动细胞凋亡。近年来的临床应用发现NSCLC患者对EGFR-TKI敏感性存在个体差异。研究表明对EGFR-TKI敏感的NSCLC患者常有EGFR18、19、21外显子突变，而这些突变多见于亚裔、女性、非吸烟及组织类型为腺癌的NSCLC患者；瘤细胞携带EGFR激活突变的患者对EGFR-TKI治疗有效率可达70%以上。然而，随着EGFR-TKI用药时间的延长，一些原本对该药敏感的NSCLC也会产生获得性耐药，获得耐药是患者该药治疗失败的主要原因。目前，传统化疗药物的耐药机制已经较为明确，主要有：①药物转运的改变，如P-糖蛋白的过表达；②药物作用靶分子的改变，如拓扑异构酶（Topo）表达质和量的改变；③细胞解毒能力的增强，如谷胱苷肽转移酶（GST-π）表达增强；④凋亡障碍，如BCL-2表达升高等。然而，传统化疗药物主要是作用于细胞核，是细胞毒性药物，需要进入细胞内执行其杀伤作用；而EGFR-TKI作用于细胞膜，抑制肿瘤细胞的增殖，并不直接杀伤肿瘤细胞，因此，用传统化疗药物的耐药机制难以解释肿瘤细胞EGFR-TKI获得性耐药，EGFR-TKI的耐药机制已成为近年来肿瘤临床基础研究的热点。文献报道与EGFR-TKI获得性耐药发生相关的因素主要有：EGFR20外显子的T790M突变、EGFR下游通路中KRAS、BRAF、MAPK、PI3K等编码基因突变、MET基因扩增及上皮-间质转化等。这些因素中EGFR20外显子T790M突变是NSCLC患者发生EGFR-TKI获得性耐药的主要原因。细胞受到传统化疗药物攻击发生损伤时，细胞会利用自身的修复系统修复受损结构，降低突变率，保持遗传稳定性。错配修复（mismatch repair，MMR）系统的功能是修复细胞基因复制时出现的碱基错配，维持机体细胞基因组的稳定。MMR系统功能异常是否也是EGFR-TKI作用于肿瘤细胞时细胞易发生包括T790M在内的基因突变的原因，值得探讨。在本研究中，我们选用携带和未携带EGFR T790M突变的两株肿瘤细胞NCI-H1975和NCI-H1650，观察细胞在gefitinib长期反复作用下发生的生物学变化和错配修复基因表达的变化，希望能够回答在EGFR-TKI作用时肿瘤细胞为什么容易发生突变，以及发生了T790M突变的细胞又是通过什么机制摆脱EGFR-TKI对其的抑制作用。方法：一、NCI-H1650细胞和NCI-H1975细胞EGFR-TKI耐药性的检测MTT法检测NCI-H1650和NCI-H1975细胞抑制率；流式细胞仪检测这两株细胞的细胞凋亡；二、EGFR第19外显子缺失突变NSCLC细胞株NCI-H1650在TKI作用下的生物学变化及耐药产生机制（一）Gefitinib耐药细胞株NCI-H1650/GR的建立1.采用聚合酶链式反应-高分辨率融解曲线分析（PCR-HRMA）和直接测序方法鉴定NCI-H1650细胞的EGFR和KRAS基因突变；2.采用逐步递增药物浓度、间歇作用体外诱导法诱导细胞株NCI-H1650产生获得性耐药；3.用MTT法检测耐药细胞抑制率和耐药指数；4.用台盼蓝拒染法计数活细胞数，制作gefitinib对亲本细胞和耐药细胞的抑制曲线。（二）耐药细胞株NCI-H1650/GR的生物学特征1.倒置显微镜下直接观察NCI-H1650和NCI-H1650/GR细胞的形态及在gefitinib作用下的形态变化；2.细胞计数法描绘亲本株和耐药株的生长曲线并计算群体倍增时间；3.流式细胞仪分析亲本株和耐药株及其在gefitinib作用下的细胞周期分布；4.流式细胞仪分析亲本株和耐药株及其在gefitinib作用下的细胞凋亡；（三）耐药细胞株NCI-H1650/GR的EGFR信号通路部分节点蛋白表达的检测免疫细胞化学法和Western-Blotting法检测耐药株与亲本株中EGFR、pY1068-EGFR、KRAS和BRAF蛋白的表达。（四）耐药细胞株NCI-H1650/GR的EMT相关蛋白的检测免疫细胞化学法检测E-cadherin和vimentin蛋白的表达。（五）耐药细胞株NCI-H1650/GR的EGFR和KRAS基因突变的检测采用PCR-HRMA法检测耐药株EGFR和KRAS基因突变。三、EGFR T790M突变NSCLC细胞株NCI-H1975在TKI作用下的生物学变化及耐药产生机制同方法二。四、细胞株NCI-H1650和NCI-H1975在TKI作用下错配修复蛋白hMSH2和hMLH1表达的变化免疫细胞化学法和Western-Blotting法检测错配修复蛋白hMSH2和hMLH1在细胞株NCI-H1650和NCI-H1975及其它们耐药株中的表达；实时荧光定量PCR法检测错配修复基因hMSH2mRNA在NCI-H1975和NCI-H1975/GR细胞中的表达。结果：一、NCI-H1975细胞和NCI-H1650细胞EGFR-TKI的耐药性MTT法检测NCI-H1650细胞IC50是18.31μmol/L，这个浓度高于NCI-H1975细胞IC50值6.145μmol/L；但细胞凋亡分析显示：NCI-H1650细胞凋亡比例呈剂量依赖性增多，而NCI-H1975细胞凋亡比例不呈剂量依赖性增多。二、EGFR第19外显子缺失突变NSCLC细胞株NCI-H1650在TKI作用下的生物学变化及耐药产生机制（一）Gefitinib耐药细胞株NCI-H1650/GR的建立1. HRMA检测结果显示：NCI-H1650细胞EGFR19和20外显子有突变；经DNA测序鉴定EGFR19外显子突变为缺失突变，即为del E746-A750；20外显子突变为第2607位碱基G→A，为无义突变，符合研究需求。2.历时12个月的gefitinib诱导耐药，获得了耐药细胞株NCI-H1650/GR。3. MTT法检测亲本细胞和耐药细胞的IC50分别为18.31μmol/L和39.494μmol/L；耐药指数为2.157。4.在同一作用时间内，亲本株和耐药株存活细胞数与gefitinib作用浓度呈剂量依赖负相关；在同一浓度gefitinib作用下，耐药株活细胞数总是多于亲本株。（二）耐药细胞株NCI-H1650/GR的生物学特征1.耐药株细胞与亲本株相比形态上存在差异，大部分细胞由亲本株的类圆形或多边形变为梭形，且体积增大。2.亲本株和耐药株的群体倍增时间分别为56.183±2.459h和69.414±2.067h，（P＜0.05），耐药株的群体倍增时间比亲本株延长了13.231±4.518h。3.与亲本株相比，耐药株G0/G1期细胞比例增多，S期细胞比例减少，异倍体细胞明显增多。 Gefitinib作用24h后亲本株细胞阻滞于G0/G1期；而耐药株没有G0/G1期阻滞，但仍有大量异倍体。4.与亲本株相比，耐药株凋亡细胞比例增多，但差异无显著性意义（P＞0.05）。在低浓度gefitinib作用后，亲本株凋亡细胞比例呈剂量依赖性增长，耐药株凋亡细胞比例并不随药物浓度增加而增加；高浓度时耐药株与亲本株凋亡细胞比例均明显增多，但耐药株凋亡细胞比例少于亲本株。（三）耐药株NCI-H1650/GR的EGFR信号通路部分节点蛋白表达与亲本株相比，耐药株的EGFR、pY1068-EGFR、KRAS表达增强、BRAF表达降低。（四）耐药株NCI-H1650/GR的EMT与亲本株相比，耐药株E-cadherin表达减弱，vimentin表达增强。（五）耐药株NCI-H1650/GR的EGFR和KRAS基因突变经PCR-HRMA法检测耐药株EGFR和KRAS基因突变，未发现新的突变。三、EGFR T790M突变NSCLC细胞株NCI-H1975在TKI作用下的生物学变化及耐药产生机制（一）Gefitinib耐药细胞株NCI-H1975/GR的建立1. HRMA检测结果显示：NCI-H1975细胞EGFR20和21外显子有突变；经DNA测序鉴定EGFR20外显子除T790M突变外，还有第2607位碱基G→A的杂合突变，21外显子突变为L858R突变。2.历时8个月的gefitinib诱导耐药，获得了耐药细胞株NCI-H1975/GR。3. MTT法检测亲本细胞和耐药细胞的IC50分别为6.145μmol/L和12.343μmol/L；耐药指数为2.009。4.在同一作用时间内，亲本细胞株和耐药细胞株存活细胞数与gefitinib作用浓度呈剂量依赖负相关。在相同浓度作用下，亲本株的活细胞数随着药物作用时间的延长而减少；而耐药株的活细胞数在第一天下降后开始缓慢升高。（二）耐药株NCI-H1975/GR的生物学特征1.耐药细胞株与亲本细胞株相比形态上存在差异，大部分细胞由亲本细胞株的长梭形变为纺锤形，且体积减小。2.亲本细胞株和耐药细胞株的群体倍增时间分别为30.531±1.823h和46.535±0.428h，（P＜0.05）；耐药株的群体倍增时间比亲本株延长了16.004±1.426h。3.与亲本株相比，耐药株G0/G1期细胞比例略增加，异倍体也增加，但其差异无统计学意义（P＞0.05）。在gefitinib作用24h后，亲本细胞株和耐药细胞株G0/G1期细胞比例均明显增高（P＜0.05），S期细胞减少，异倍体消失。4.与亲本株相比，耐药株凋亡细胞比例增多（P＜0.05），在低浓度（20μmol/L）gefitinib作用下，NCI-H1975/GR细胞凋亡细胞比例减少（P＜0.05）；而在高浓度（40和80μmol/L）gefitinib作用下，凋亡细胞比例增高（P＜0.05）。无论是亲本株还是耐药株，在40μmol/L的gefitinib作用下凋亡比例最高，但药物浓度达到80μmol/L时，凋亡细胞比例反而减少。（三）耐药细胞株NCI-H1975/GR的EGFR信号通路部分节点蛋白表达与亲本株相比，耐药株EGFR、KRAS、BRAF表达降低，但是pY1068-EGFR高表达。（四）耐药细胞株NCI-H1975/GR的EMT与亲本株相比，耐药株E-cadherin表达减弱，vimentin表达增强。（五）耐药细胞株NCI-H1975/GR的EGFR和KRAS基因突变经PCR-HRMA法检测耐药株EGFR和KRAS基因突变，未发现新的突变。四、细胞株NCI-H1650和NCI-H1975在TKI作用下错配修复蛋白hMSH2和hMLH1表达的变化NCI-H1975细胞产生gefitinib获得性耐药后hMSH2和hMLH1蛋白表达增高；耐药株及亲本株错配修复基因hMSH2mRNA表达含量无显著性差异。NCI-H1650细胞产生gefitinib获得性耐药后hMSH2蛋白表达增高，hMLH1表达下降。结论：1.采用逐步递增药物浓度、间歇作用体外诱导法成功建立了EGFR19外显子突变细胞株的gefitinib耐药株NCI-H1650/GR（耐药指数为2.157），同样的方法建立了EGFR T790M突变的gefitinib耐药株NCI-H1975/GR（耐药指数为2.009）。2. T790M突变细胞在gefitinib长期作用后细胞增殖速度减慢幅度大于无T790M突变细胞；3.经长期药物作用后，再次受到EGFR-TKI作用时，T790M突变细胞会停滞于G0/G1期；相反无T790M突变的细胞不出现G0/G1期阻滞；4.抗凋亡作用可能是19外显子缺失突变细胞株产生EGFR-TKI获得性耐药机制之一；5.19外显子突变细胞株NCI-H1650细胞发生获得性耐药后，表现为EGFR和KRAS基因表达上调和BRAF基因表达下调；T790M突变细胞株NCI-H1975发生EGFR-TKI获得性耐药后，EGFR/KRAS/BRAF通路处于封闭状态；6. NCI-H1650发生EGFR-TKI获得性耐药后错配修复基因hMSH2表达增高、hMLH1表达降低；而T790M突变细胞NCI-H1975发生EGFR-TKI获得性耐药后hMSH2和hMLH1表达增加。7. EMT可能是有或者没有T790M突变NSCLC的EGFR-TKI耐药共同机制。