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研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全世界第四大致命的常见癌症[1]。虽然在过去的几十年中,CRC筛查广泛开展使早期癌发现率增高[2]。但是,CRC仍是进展较快的恶性肿瘤,病人总体预后较差[3]。因此,进一步洞察CRC进展的分子机制,可以确定新的治疗靶点,从而改善CRC的预后。Hippo通路首先在果蝇的研究中发现,被认为与组织器官生长相关[4]。Hippo通路有很多组件如:PDF转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif TAZ),Yes相关蛋白质(Yes-Associated Protein YAP),哺乳动物STE20样激酶1/2(Mammalian STE20-like kinase MST1/2)[5,6]。之前的研究结果显示,Hippo通路的成员,特别是MST1,参与细胞生长、增殖、凋亡、维持器官大小和肿瘤发生并发挥重要作用[7,8]。同时,早期CRC病人低表达MST1预示预后不良[9,10],这表明MST1失调可能与CRC的进展有关。虽然很多研究报道在乳腺癌、肺癌和肝细胞癌中Hippo通路的表达受到抑制,但很少有Hippo通路在CRC中的系统研究。线粒体和癌症之间有着密切的关系[11,12],充分的证据肯定了线粒体的致病效应在癌症发生和发展中的作用[13,14]。此外,线粒体还通过调节细胞能量代谢参与癌症的侵袭和转移[15,16]。最近的研究表明,线粒体自噬是维持线粒体数量和质量的管家[17,18],癌细胞需要通过线粒体自噬清除受损或功能缺陷的线粒体来促进癌细胞的代谢[19]。然而,一个不平衡的线粒体降解过程会影响细胞能量的产生,甚至启动细胞凋亡,进而阻止癌细胞的进展。这些信息表明抑制线粒体自噬可能是CRC的潜在治疗靶点。日本学者Nakamura研究发现,MST1可以诱导线粒体损伤而激活细胞凋亡[20]。这一结论表明MST1与线粒体稳态之间存在着复杂的相互作用。但是,MST1在CRC进展过程中如何调控线粒体自噬,MST1与线粒体自噬之间存在怎样的分子通路,这些都是未知的。研究目的:本研究旨在探索MST1调控直肠癌细胞生长的机制。研究MST1对直肠癌细胞凋亡、增殖和迁移的影响是否通过干扰线粒体自噬来实现,并进一步探讨MST1影响线粒体自噬的分子机制,为靶向治疗直肠癌提供新策略。研究方法:体外实验:明确MST1对直肠癌细胞系SW837生物学行为的影响及可能机制。分三部分。第一部分:通过Western blots技术检测直肠癌细胞系SW837和正常肠粘膜细胞FHC中MST1的表达情况。通过腺病毒转染技术,使SW837中MST1水平显著上升,建立过表达MST1稳定细胞系。通过MTT法,TUNEL法、BrdU法和Transwell法分析MST1对直肠癌细胞凋亡、增殖和迁移的影响。通过Western blots技术检测凋亡、增殖和迁移相关蛋白的表达水平。第二部分:通过JC1染色,mPTP开放实验、Cyt-c免疫荧光以及ATP和ROS水平测定MST1对线粒体功能的影响。通过Western blots技术检测线粒体自噬相关蛋白,并利用线粒体和溶酶体的免疫荧光共染色分析MST1对线粒体自噬的影响。第三部分:利用线粒体自噬激活剂FCCP、JNK抑制剂SP600125(SP)和P53siRNA,通过Western blots技术、免疫荧光等方法来探讨MST1与线粒体自噬之间可能的信号通路。体内实验:验证MST1在体内对裸鼠直肠癌细胞移植瘤生长的影响。将对照组SW837和过表达MST1的SW837移植到裸鼠腋部皮下,45天后处死,取出移植瘤,测量移植瘤体积和重量。通过Western blots、qRT-PCR方法检测移植瘤组织中JNK、Caspase 3和Caspase 9的表达情况及Cyclin D和Cyclin E的mRNA水平。同时对移植瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。研究结果:体外实验:MST1通过激活JNK/p53通路抑制BNIP3介导的线粒体自噬诱导直肠癌细胞凋亡,抑制直肠癌细胞的增殖和迁移。第一部分:与正常肠粘膜细胞相比,MST1在直肠癌细胞中表达下调(P<0.05)。然而,过表达MST1可诱导直肠癌细胞凋亡,抑制癌细胞的增殖和迁移。过表达MST1明显增加了Caspase3、Caspase9、Bax的表达水平,降低了X-IAP的表达(P<0.05)。过表达MST1可以明显下调Cyclin D、Cyclin E及CXCR4、CXCR7的表达水平(P<0.05),但是这种效应可以被线粒体激活剂FCCP逆转。第二部分:过表达MST1明显增加mPTP开放率及显著降低线粒体膜电位(P<0.05),并触发Cyt-c扩散进入细胞质,甚至进入细胞核。通过Western blots检测,细胞质中Cyt-c水平明显增加而线粒体中Cyt-c水平明显降低(P<0.05)。过表达MST1导致ATP水平明显减少及ROS水平显著增加(P<0.05)。过表达MST1可以显著减少自噬相关蛋白mito-LC3II、Beclin1和ATG5的表达水平(P<0.05),荧光染色下减少线粒体与溶酶体之间的重叠。第三部分:过表达MST1抑制BNIP3的表达,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。过表达MST1可以激活p53,使p53磷酸化增加。对BNIP3进行免疫荧光检测,同时使用siRNA阻断p53的激活,过表达MST1抑制BNIP3免疫荧光强度,然而阻断p53基因逆转了这一变化。过表达MST1明显增加了JNK的表达,而使用JNK抑制剂SP600125可以降低p53磷酸化的水平。对p53和JNK进行免疫荧光共染色,JNK和p53之间有同步的变化,而且抑制JNK降低了p53的免疫荧光强度。体内实验:过表达MST1组的移植瘤体积、重量较对照组明显减小(P<0.05),JNK、Caspase 3和Caspase 9蛋白表达水平显著增高(P<0.05),Cyclin D和Cyclin E mRNA水平显著降低(P<0.05)。研究结论:MST1是一个参与直肠癌凋亡、增殖和迁移的肿瘤抑制因子。MST1通过激活JNK/p53通路抑制BNIP3介导的线粒体自噬抑制直肠癌细胞的生长。