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中期因子(midkine，MK)是一个由121个氨基酸组成的分子量约为1.kDa的碱性蛋白质，属于肝素结合生长因子家族，其在人胚胎的肝、肾和脑部组织中高表达，但在健康成人体内表达量却很低，然而在肿瘤患者体内表达量又会显著地升高。研究发现MK在很多方面显示与肿瘤发生有关的活性，包括促细胞增殖、转化、血纤蛋白溶解、血管新生和抗细胞调亡等，但对其发挥一系列生物学功能的机理却并不明了。基于蛋白质相互作用在生命活动的重要性，本硕士学位论文利用酵母双杂交技术筛选MK的相互作用蛋白质，为深入研究MK参与的分子途径、阐明其发挥功能的分子机理打下基础。
我们首先将MK全长基因克隆至Invitrogen公司ProQuest酵母双杂交系统的诱饵载体pDBLeu中，构建成功的pDBLeu-MK转化酵母细胞MaV203，对该双杂交系统的两个报告基因lacZ和URA3分别进行检验后确定MK无自身转录激活能力。在此基础上，通过小规模筛库，确定在大规模筛库中使用2.mM的3AT浓度以及1.μgcDNA文库量较为合适。在大规模筛库后，我们从2×106数量的转化子中筛选得到51个可能的阳性克隆。经过X-gal方法的检验，确定其中30个克隆呈阳性。抽提得到酵母阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素筛选获得文库质粒，测序并将结果在GenBank中进行BLAST序列比对，共得到6个不同的蛋白质。最后将筛选获得的文库质粒分别与pDBLeu和pDBLeu-MK共转化酵母进行自身活性鉴定及活性再鉴定，并最终确定5个候选蛋白，它们分别为Dvl-bindin.protei.nake.cuticle2(NKD2)、磷脂混杂酶1(phospholipi.scramblas.1,PLSCR1)、颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)和潜活TGF-β结合蛋白3，4(laten.transformin.growt.factorbet.bindin.protei.3an.4，LTBP-3.-4)。
由于酵母双杂交技术本身的缺陷，所得到的相互作用蛋白质还需通过pulldown、FRET、co-IP等方法进行进一步验证。因此在本论文的第二部分，我们采用了i.vitropulldown的方法来初步验证筛选获得的相互作用的真实性。首先我们将各个蛋白的全长基因克隆到体外表达载体pCMVTnT中，然后在Promega公司的TNT快速转录/翻译耦联系统中分别表达35[S]-甲硫氨酸标记的蛋白。将表达产物分别与原核表达纯化的His-MK共孵育，利用特异性结合His标签的镍珠将孵育后的复合物沉淀下来，并通过SDS-PAGE分离复合物，最后放射自显影检测35[S]-甲硫氨酸标记的蛋白是否被His-MK共沉淀下来，从而确定它们是否与MK发生相互作用。目前为止，我们利用此方法验证了NKD2、PLSCR1、PGRN与MK能在体外发生直接的相互作用。
在本研究中所筛选到的MK相互作用蛋白质有细胞外基质组分，也有胞内重要的信号分子，暗示中期因子可能参与的生物学过程的多样性以及它在其中发挥作用的机制的复杂性。研究结果不仅为阐明中期因子发挥生物学功能的分子机制提供了新的线索，而且这些相互作用蛋白可能是肿瘤治疗的理想靶标。