论文部分内容阅读
不良的药代动力学特征,药物的毒副作用,特别是药物耐药性的出现,使化疗药物在临床肿瘤治疗中的效果大幅降低。而海洋复杂多变的生存环境,赋予了生活在其中的生物特殊的抵御手段,这些化学或者生物适应产生了许多具有特殊生物活性和潜在抗肿瘤效应的化合物。Thiocoraline即噻可拉林,为含硫缩肽,是一种DNA双嵌插剂,最初是从海洋单胞菌Micromonospora marina中分离得到,在抗癌活性方面有很好的效果。本课题以thiocoraline为研究对象,研究thiocoraline抗肿瘤活性及乳腺癌对thiocoraline产生耐药的分子机制。使用MTT法检测thiocoraline对MCF-7细胞,L-02细胞的毒性作用;利用MTT法和结晶紫染色比较thiocoraline和doxorubicin对MCF-7细胞的作用效果;流式细胞术检测thiocoraline对细胞周期的影响;Hoechst 33342和Western Blot检测thiocoraline诱导细胞凋亡情况;通过浓度梯度递增法培养得到对thiocoraline耐药的MCF-7/T细胞株,并确定其耐药指数。利用生长曲线和克隆形成实验比较MFC-7细胞与MCF-7/T耐药细胞的生物学特征。通过半定量PCR初步筛选出与thiocoraline相关的耐药靶点;qPCR,Western Blot进一步分析比较耐药细胞MCF-7/T与MCF-7细胞之间的差异。针对Akt位点,用慢病毒构建的MCF-7/Akt1细胞株和Akt磷酸化抑制剂MK-2206 HCl,通过MTT法及Western Blot实验深入研究thiocoraline引起MCF-7耐药的分子机制。利用MK-2206 HCl抑制MCF-7/T耐药细胞中Akt蛋白的磷酸化,通过MTT法检测其逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline耐药性的作用效果。MTT法和结晶紫实验结果表明thiocoraline对MCF-7细胞具有显著的杀伤活性,在纳摩尔级的浓度下即可发挥抗肿瘤效应。肝正常细胞L-02对thiocoraline不敏感,当thiocoraline浓度为100 nmol/L时,L-02细胞的成活率为69.43±13.48%。Thiocoraline对MCF-7细胞48h的IC50值为53.8±2.53 nmol/L,与doxorubicin相比,对肿瘤细胞有更高的细胞毒性。流式细胞仪分析MCF-7细胞周期结果表明,thiocoraline可将MCF-7细胞的细胞周期阻滞在S期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。Hoecst 33342染色和Western Blot实验结果显示,thiocoraline可通过激活Caspase通路而诱导细胞发生凋亡。在前期系列天然产物抗肿瘤活性研究基础上,针对乳腺癌细胞耐药性这个突出问题,以乳腺癌耐药细胞MCF-7/T为研究模型,筛选与thiocoraline耐药相关的蛋白,深入探究影响肿瘤细胞对药物敏感性的因素。通过细胞生长曲线和克隆形成实验发现MCF-7细胞在体外的增殖速率高于MCF-7/T细胞。qPCR和Western Blot实验显示,thiocoraline作用MCF-7细胞后,引起Akt蛋白磷酸化,长期作用下使下游乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistant Protein,BCRP)的表达水平升高,通过PI3K/Akt/BCRP通路诱导细胞产生耐药性。MTT实验结果表明,MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,随着细胞内Akt蛋白磷酸化水平的提高而降低。使用Akt磷酸化抑制剂MK-2206 HCl可显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,并且可部分逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline的耐药。总之,thiocoraline长期处理可使MCF-7细胞通过PI3K/Akt/BCRP通路产生耐药性,而MK-2206 HCl通过抑制Akt蛋白磷酸化,显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,上述实验结果表明抗肿瘤活性化合物thicoraline联合Akt磷酸化抑制剂MK-2206 HCl,或许可以避免化疗药物耐药性,为乳腺癌的临床治疗研究提供相关实验依据。