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固有免疫是机体防御病原微生物入侵的第一道防线,主要通过一系列高度保守的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别某些病原体或其产物的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)而激活。NLRs(Nucleotide-binding domain and oligomerization domain-like receptors,核苷酸结合寡聚化结构域样受体)作为一类胞内模式识别受体,在炎症反应和病原微生物清除过程中发挥功能。NLRPs(NACHT,LRR and PYD domains-containing proteins)为NLRs超家族成员,是新近发现的一类胞内PRRs,因其能够参与炎性小体(inflammasome)的形成而受到广泛关注。NLRPs炎性小体复合物由NLRPs家族蛋白、衔接蛋白ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,凋亡相关斑点样蛋白)和效应分子Caspase-1(半胱天冬酶-1)三个结构所组成。俗称“娃娃鱼”的中国大鲵(Andrias davidianus),为国家二级保护水生野生动物,是我国特有的现存体型最大的有尾两栖动物,在进化上具有重要地位。然而,因病原微生物感染,尤其是养殖过程中细菌感染引起大鲵发病的报道逐渐增多,已成为限制大鲵养殖产业健康发展的重要因素。深入开展大鲵抗菌防御机制研究,对促进大鲵养殖业的可持续健康发展具有重要的现实意义。在本研究中,采用逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactio,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法克隆获得了中国大鲵NLRPs家族成员(AdNLRP1,AdNLRP3和AdNLRP-like)、AdASC和AdCaspase-1的cDNA序列,采用生物信息学方法对序列进行分析,并采用荧光定量PCR(realtime qPCR,qPCR)方法对上述基因在正常组织和细菌感染后不同组织的表达模式进行研究。结果如下:(1)本文首先对NLRPs炎性小体成员AdNLRP1、AdNLRP3、AdNLRP-like、AdASC和AdCaspase-1进行了基因克隆,并对上述基因的序列特征进行了分析。AdNLRP1、AdNLRP3、AdNLRP-like、AdASC和AdCaspase-1克隆到的序列长度分别为558 bp、2816 bp、564 bp、2034 bp和403 bp;开放阅读框(open reading frame,ORF)编码核苷酸数量分别是:185 aa(amino acids)、871 aa、187 aa、444 aa和122 aa。SMART预测和多序列分析结果证明AdNLRP1、AdNLRP3、AdASC和AdCaspase-1含保守的结构域,而AdNLRP-like不具有保守结构域。系统进化树分析表明AdNLRP1、AdASC和AdCaspase-1在进化上与爬行动物相近,而AdNLRP3与哺乳动物相近。(2)荧光定量PCR检测了AdNLRP1、AdNLRP3、AdNLRP-like、AdASC和AdCaspase-1在健康大鲵不同组织中的表达情况。结果表明AdNLRP1、AdNLRP3、AdNLRP-like、AdASC和AdCaspase-1在所检测的组织中呈组成型表达;进一步,分析了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)腹腔感染后的表达情况。结果显示在嗜水气单胞菌感染后,AdNLRP1、AdNLRP3、AdNLRP-like、AdASC和AdCaspase-1的表达水平在不同组织中呈显著上调表达。在本研究以大鲵为实验对象,首次对NLRPs炎性小体成员NLRP1、NLRP3、NLRP-like、ASC和Caspase-1进行克隆和表达分析,阐明了大鲵NLRPs炎性小体在细菌感染过程中的表达变化规律。研究结果将对深入了解大鲵NLRPs炎性小体免疫功能和机制奠定坚实基础。