进入21世纪后,随着生物科技的迅猛发展,以微生物为操作对象的代谢工程产业取得了长足的进展。大肠杆菌因其有着易培养,遗传背景清楚等特点,常被用来作为代谢工程改造的出发菌株。利用代谢工程的各种手段对大肠杆菌的代谢途径进行进一步改造,可以使它成为生产各种工业原料和重要药物的生物炼制细胞工厂。而对大肠杆菌自身的代谢网络及相关调控的深入研究,则为大肠杆菌的代谢工程改造提供了理论基础和研究方向。大肠杆菌包含不同的种系。为了开发更适合代谢工程使用的大肠杆菌菌株,本论文利用系统生物学的方法对比了大肠杆菌用于分子改造的K-12系列代表菌株MG1655和用于蛋白表达的B系列代表菌株BL21(DE3)在好氧和厌氧情况下的代谢特征。本论文发现,好氧情况下,在以葡萄糖为单一碳源的AM1培养基上,BL21的生长速率和最终OD值都要低于MG1655。13C标记的代谢流分析表明,BL21的TCA循环有着较大的流量,而MG1655则有着较大比例的乙酸溢出。旺盛的TCA循环可能是BL21乙酸积累较少的原因之一。通过代谢流分析和基因表达水平的分析发现,在这个条件下,BL21的乙醛酸支路是被抑制的,与MG1655一样。葡萄糖磷酸转移酶系统主要运输蛋白PtsG的敲除降低了葡萄糖在两种菌里面的运输速率,同时增大了二者的TCA循环和磷酸戊糖途径的流量。发生这样变化的主要原因还有代谢调控因子Crp-cAMP在PtsG敲除后被激活,从而对整个代谢网络的许多基因进行了相应的调控。通过与未敲除ptsG日U的菌株的对比发现,ptsG基因的敲除对MG1655的影响大于对BL21的影响,可能是在BL21野生菌株里面存在着某种调控机制,发挥了部分Crp-cAMP对代谢的调控作用。除了生长情况,代谢流分配等代谢指标的不同外,本论文还发现BL21在好氧情况下会持续分泌维生素B2—核黄素这一特点。文中对比了BL21和MG1655胞内的FAD水平,发现在BL21中有着更高的FAD水平,这可能是核黄素积累对菌体代谢的直接影响。已知FAD是细胞氧化的一些重要酶类的配体,它的量可能会影响到这些酶的数量和活性,进而影响到TCA循环的流量大小。我们推断核黄素的积累可能就是BL21比起MG1655的TCA循环更加旺盛的重要原因之一。通过比较由核黄素生成FMN, FAD的核黄素激酶/FAD合酶双功能酶(RibF)的酶活,发现该酶在BL21中的酶活低于MG1655。通过序列比对发现在BL21中有一个氨基酸位点发生了突变。因此我们推测在BL21中核黄素积累的原因是由于RibF的突变引起的酶活不足导致的反馈调节。在厌氧条件下,BL21生长缓慢且不稳定,OD值较低。经产物分析发现BL21的主要产物之一为乳酸,而MG1655的乳酸产量则很低。为了改善BL21在厌氧条件下的生长状况,我们在BL21中组成型表达了MG1655的丙酮酸-甲酸裂解酶pflB基因,发现BL21的生长速率和最终OD都有了明显的提高。这是因为在厌氧条件下,菌体生长来源的ATP主要由发酵途径的底物水平磷酸化偶联生成。菌体代谢中乙酸的生成偶联了1分子ATP的生成。BL21的乳酸产量较多,而乙酸相对较少,过表达pflB后,BL21的乙酸生成增加,合成的ATP的量也提高,因此改善了BL21厌氧情况下的生长。同时,ptsG的敲除解除了厌氧条件下对Crp-cAMP的抑制,提高了BL21的乙酸和琥珀酸产率,但是由于葡萄糖主要转运蛋白的缺失,在厌氧条件下它的生长仍然缓慢。本论文对大肠杆菌BL21(DE3)和MG1655自身的代谢网络和相关的调控机制有了一定的研究,为进一步有针对性地利用和代谢工程改造大肠杆菌提供了理论基础和研究方向。