目的：抗原特异性免疫应答的诱生很大程度上取决于机体对该抗原分子的处理和递呈的效率。树突状细胞(dentritic cells，DCs)是体内的专职抗原递呈细胞，具有活跃地摄取、处理抗原的能力，可有效地向T细胞呈递抗原、激发初次细胞免疫应答。因此，在抗原注射部位DCs的数量及其对抗原的摄取能力是制约抗原特异性免疫应答的重要因素。基于DCs在免疫应答中具有重要作用，如果招募包括DCs在内的APCs至靶抗原所在部位，增加对抗原的摄取和递呈，则有利于增强免疫效果。 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)为集落刺激因子家族成员之一，属于酪氨酸激酶受体，可刺激CD34+造血干细胞的增殖和分化，并诱导特定亚群的DC细胞成熟。通过注射F1t3L可以使抗原特异性免疫反应显著增强，并显著增加DC的数量和频率。另外，Flt3L与多种细胞因子有协同作用，是一种良好的DCs细胞扩增剂。RANTES(regulated uponactivation normal T cell expressed and secreted)即CCL5是趋化因子CC家族的重要代表之一，主要趋化单核细胞、初始T细胞及活化T细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，其趋化活性是MIP-1的10倍。 核酸疫苗作为第三代疫苗，在抗感染、抗肿瘤免疫的研究中有着巨大潜力和应用价值，但由于其免疫原性较低，单独使用核酸疫苗很难诱导出具有预防和治疗作用的强大且持续性的细胞免疫应答。因而，近些年核酸疫苗的设计和研究主要集中在如何提高其免疫原性及诱导较强的细胞免疫应答上。具有调节作用的细胞因子能够有效激活和调节免疫活性细胞，促进其分化和增生，经细胞因子活化后的专职性抗原提呈细胞能够有效地激活抗原特异性CTL细胞。而具有趋化作用的趋化因子能够趋化抗原提呈细胞在淋巴组织中的定位，调节免疫应答反应的强弱。将细胞因子或趋化因子与其他一些免疫调节分子联用，作为佐剂协同核酸疫苗进行免疫，共同调节体内免疫细胞，最终达到增强免疫效果的目的。本研究中我们克隆了小鼠Flt3L/RANTES基因，构建了真核表达载体pFlt3L/pRANTES；另外，为了能通过小鼠体内评价系统研究Flt3L及RANTES的分子佐剂效应，构建了表达HBc抗原的真核表达质粒pHBc作为模型核酸疫苗，并建立了稳定表达HBcAg的小鼠黑色素瘤细胞株B16-HBc。通过动物实验观察了真核重组表达质粒pFlt3L及pRANTES对携带HBc抗原的DNA疫苗诱导的抗原特异性免疫应答的促进作用。同时为了能够更好的诱导出细胞免疫反应，我们采用经携带HBc抗原的DNA疫苗初免及原核表达的HBc颗粒蛋白加强免疫的“Prime-Boost”免疫方案免疫小鼠，同时以真核表达载体pFlt31和pRANTES作为佐剂，研究了Flt3L/RANTES联合应用在Prime-boost免疫策略中对稳定表达HBcAg的小鼠黑色素瘤细胞(B16-HBc细胞)攻击的免疫保护作用，并对可能的机制进行了探索。 方法： 1.真核表达载体pF1t3L、pRANTES的构建及F1t3L与RANTES生物学活性鉴定采用RT-PCR方法从小鼠骨髓及外周血单个核细胞扩增得到F1t3L及RANTES全长基因片断，分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His，得到重组表达质粒pF1t3L和pRANTES。将pF1t3L和pRANTES分别用脂质体的方法转染HepG2细胞，然后采用骨髓细胞增殖及趋化小室实验检测细胞上清F1t3L及RANTES两种细胞因子的生物学活性。另外，为了进一步检测pF1t3L、pRANTES或pF1t3L/pRANTES混合质粒在小鼠体内招募炎性细胞的浸润情况，以PBS、pcDNA3.1/V5-His、pF1t3L、pRANTES及pF1t3L/pRANTES混合质粒，给小鼠腿部肌肉注射，一周后，取注射局部肌肉组织，常规进行石蜡切片及HE染色。 2.真核表达载体pHBc的构建及稳定表达HBc的小鼠黑色素瘤B16-HBc的建立构建表达HBcAg的真核表达质粒pHBc作为模型核酸疫苗；同时将pHBc经脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞，G418筛选阳性克隆，并分别采用RT-PCR和Western blot检测阳性克隆中HBc的表达，以此作为制备小鼠荷瘤模型的肿瘤细胞株。 3.用正常小鼠为模型对重组质粒pF1t3L和pRANTES对DNA疫苗的免疫促进作用进行评价将pF1t3L和pRANTES单独或联合使用与携带HBc抗原的DNA疫苗经肌内注射法免疫小鼠，即将小鼠分为pF1t3L/pHBc组(F组)、pRANTES/pHBc组(R组)及pF1t3L/pRANTES/pHBc组(F/R组)，以pcDNA3.1/V5-His(P组)和pHBc组(H组)为阴性对照，每2周一次，共免疫3次。采用MTT法检测脾淋巴细胞增殖、流式细胞仪检测小鼠脾脏中表达IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数、ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IL-4含量及乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL杀伤活性。 4 用荷瘤小鼠模型观察重组表达质粒pFlt3L和pRANTES在DNA/prime-protein/boost免疫策略中对免疫应答的促进作用将两种重组真核表达质粒pFlt3L和pRANTES联合使用作为佐剂与携带HBc抗原的DNA疫苗经肌内注射进行免疫小鼠，然后以大肠杆菌表达的HBc颗粒蛋白加强，即给小鼠注射两次pFlt3L/pRANTES/pHBc，一次HBc颗粒蛋白(DDS/Adj)，用DNA疫苗加强(DDD/Adj)或不使用佐剂的DNA疫苗(DDD)做对照。末次免疫后4天，给小鼠皮下移植稳定表达HBcAg的小鼠黑色素瘤细胞株B16-HBc，观察肿瘤生长，并绘制肿瘤生长曲线。然后分别采用MTT法、流式细胞术、ELISA法及乳酸脱氢酶(LDH)释放法分别检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、小鼠脾脏中表达IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数、脾淋巴细胞培养上清IL-2、IL-4含量及特异性CTL杀伤活性。 结果： 1.真核表达载体pFlt3L/pRANTES的构建及B16-HBc小鼠黑色素瘤细胞株的建立从C57BL/6小鼠骨髓及ConA刺激的外周血单个核细胞的总RNA中，成功克隆了约708bp的Flt3L及271bp的RANTES基因，测序结果与GeneBank(AK020105及NM013653)公布的Flt3L及RANTES序列一致；成功构建了真核表达载体pFlt3L和pRANTES：骨髓细胞增殖及趋化实验证实了Flt3L及RANTES均有生物学活性。pFlt3L、pRANTES和pFlt3L/pRANTES混合质粒在小鼠体内招募炎性细胞的浸润情况结果显示，pFlt3L、pRANTES和pFlt3L/pRANTES混合质粒，注射局部肌肉组织部位大量炎性细胞聚集，而PBS、pcDNA3.1/V5-His注射局部未见明显细胞浸润。说明pFlt3L、pRANTES单独或混合在一起均可在体内获得有效表达，并表现出生物学活性。 2.Flt3L与RANTES细胞因子佐剂对DNA疫苗抗原特异性免疫应答的促进作用pFlt3L和pRANTES联合使用可显著促进小鼠脾脏特异性淋巴细胞增殖反应，刺激指数SI为1.222±0.068(P<0.05)；小鼠脾脏中高表达IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数在F、R和F/R组中，分别是3.35±0.81％、1.72±0.50％、7.71±1.04％，与对照组比均有显著差异(P<0.05或P<0.01)；而IL-4表达水平在各组无显著区别(P>0.05)；小鼠脾细胞特异性CTL活性检测中，当效靶比为50:1时，Flt3L/RANTES组显著高于其他各组(均P<0.05)。 3.Flt3L及RANTES对Prime-boost免疫策略中抗原特异性免疫应答的增强及抗肿瘤作用真核表达载体pFlt3L及pRANTES与核酸疫苗联合免疫小鼠后，肿瘤细胞接种17天后，佐剂联合DNA疫苗免疫经蛋白加强组(DDS/Adj组)瘤体积最小，为888.5mm3，与对照组相比有显著差异(P<0.05)，佐剂联合DNA疫苗免疫组(DDD/Adj组)及DDS/Adj组均可显著促进特异性淋巴细胞增殖反应(P<0.05)，且DDS/Adj组淋巴细胞增殖反应显著高于DDD/Adj组(P<0.05)；与对照组比，各组小鼠脾脏高表达IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数显著升高(P<0.01)，IL-2表达水平显著增高(P<0.05)，但IL-4表达水平在各组无显著区别(P>0.05)；DDD/Adj及DDS/Adj组小鼠脾细胞抗原特异性CTL活性显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)，且DDS/Adj组抗原特异性CTL活性显著高于DDD/Adj组(P<0.05). 结论： 1.成功构建真核表达载体pFlt3L、pRANTES并在体内外观察到其生物学活性； 2.得pHBc真核表达载体即模型DNA疫苗，建立了稳定表达HBc的小鼠B16-HBc细胞株； 3.pF1t3L和pRANTES表达质粒联用可显著诱导小鼠Th1型细胞免疫偏移，并显著促进抗原特异性免疫应答； 4.F1t3L及RANTES两种细胞因子联合应用在Prime-boost免疫策略中，可显著促进抗原特异性免疫应答及抗肿瘤作用。