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背景:小细胞肺癌(SCLC)是一类具有神经内分泌特征的肺癌亚型,侵袭性强、转移发生早、对初次化疗敏感、但易复发。数十年来,SCLC治疗方面的进展较为缓慢,目前仍是以手术(局限期)、放化疗(广泛期)为主;而近年来逐渐兴起的免疫治疗有望为SCLC的治疗带来新的突破。在整个肿瘤治疗方案的改进发展过程中,我们可以看到肿瘤治疗策略上的一些变化——最初,我们着力于针对癌细胞进行治疗,而现在的免疫治疗、抗血管生成药物等则主要是针对肿瘤微环境进行治疗。肿瘤细胞的发生发展与其周围的微环境密切相关,趋化因子作为两者之间重要的信使,扮演着重要的角色。SDF-1作为多种器官中固有表达的趋化因子,参与了多种肿瘤的发生、转移等过程。但目前关于其在SCLC中的研究尚比较欠缺,鉴于此,本实验将初步探索SDF-1在SCLC骨转移中发挥的作用。目的:探索骨转移灶中癌细胞的定位并分析它所处的微环境有何特殊性,然后检测SDF-1在骨转移灶中的表达并借助一系列体外实验检测SDF-1对SCLC细胞增殖、侵袭、粘附、凋亡、细胞周期等生物学行为的影响;最后利用小鼠成瘤模型探索SDF-1-CXCR4信号轴在SCLC骨转移中发挥的作用,为SCLC的临床治疗提供新的治疗靶点。方法:1.利用组织免疫荧光染色的方法检测SCLC骨转移灶中癌细胞的定位;2.利用体外共培养体系模拟体内SCLC骨转移灶中癌细胞的生存环境来检测成骨细胞对SCLC细胞侵袭能力的影响,并检测CXCR4拮抗剂AMD3100能否干扰这一影响;3.利用ELISA法检测成骨细胞是否可以分泌SDF-1细胞因子;4.利用组织免疫组化染色的方法检测SCLC骨转移灶中SDF-1的表达水平;5.用含不同浓度重组人SDF-1细胞因子的完全培养基或无血清培养基培养SBC-3细胞和SBC-5细胞,通过MTT实验检测细胞在SDF-1作用下的增殖情况,并找出SDF-1的有效作用浓度;6.通过Transwell实验检测SDF-1对SBC-3细胞和SBC-5细胞侵袭能力的影响,并检测AMD3100能否干扰这一作用;7.用流式细胞仪检测SDF-1对饥饿状态下的SBC-3细胞和SBC-5细胞凋亡和细胞周期的影响;8.利用纤连蛋白和骨片检测SDF-1对SBC-3细胞和SBC-5细胞粘附作用的影响;9.利用实时RT-PCR和Western blot法检测SDF-1及其受体CXCR4和CXCR7在SBC-3细胞和SBC-5细胞中的表达水平;10.利用细胞免疫荧光染色检测CXCR4和CXCR7在SBC-3细胞和SBC-5细胞中的表达定位和表达水平;11.利用慢病毒转染的方法分别对SBC-3细胞和SBC-5细胞进行SDF-1干扰和过表达处理,并验证转染细胞株在增殖、迁移、侵袭方面的变化;12.将包被有SDF-1的骨基质载体植入NOD/SCID小鼠皮下,再将SBC-5细胞经小鼠尾静脉注入小鼠体内,检测SDF-1单一因素是否能够引起SCLC细胞转移,并检测AMD3100在小鼠体内对骨转移灶形成的影响,揭示SDF-1在SCLC骨转移中发挥的作用。结果:1.SCLC细胞在其形成的骨转移灶中与HSCs(造血干细胞)和成骨细胞的空间位置极其相近,同时HSCs和成骨细胞的位置也密切相邻;2.与成骨细胞共培养的SCLC细胞有着更强的侵袭能力,而且这一作用可以被CXCR4拮抗剂AMD3100在一定程度上阻断;3.成骨细胞具有分泌SDF-1的能力;4.SDF-1在SCLC骨转移灶中的表达高于正常骨组织;5.SDF-1对饱和营养状态下的SBC-3细胞和SBC-5细胞的增殖并无影响,但可以“保护”饥饿条件下的SBC-3细胞和SBC-5细胞,SDF-1的有效作用浓度为100ng/ml;6.Transwell实验显示SDF-1能够促进SBC-3细胞和SBC-5细胞的侵袭,这一作用可以被AMD3100阻断;7.饥饿状态下的SBC-3细胞和SBC-5细胞在SDF-1作用下的凋亡率会有所增加,细胞周期结果显示SDF-1会增加SBC-3细胞和SBC-5细胞G1期细胞的比例;8.SDF-1可以增强SBC-3细胞和SBC-5细胞与纤连蛋白和骨片的粘附能力;9.在m RNA水平,CXCR4和CXCR7在SBC-3细胞的表达高于SBC-5细胞,在蛋白水平,CXCR4的表达与PCR结果一致,但CXCR7与PCR结果相反,在SBC-5细胞中的表达高于SBC-3细胞,此外SBC-3细胞和SBC-5细胞具有表达SDF-1的功能,且SBC-3细胞表达水平高于SBC-5细胞;10.CXCR4和CXCR7主要在SBC-3细胞和SBC-5细胞的胞浆和胞膜表达,表达水平与Wetern blot结果一致;11.成功建立转染细胞株SBC-3-LV3-NC、SBC-3-SDF-1-Ri和SBC-5-LV5-NC、SBC-5-SDF-1,SDF-1被干扰后,SBC-3细胞的增殖、侵袭能力减弱;而过表达SBC-5细胞中的SDF-1会增强细胞的增殖、侵袭能力;12.在NOD/SCID小鼠体内中,包被SDF-1的骨基质载体并没有检测到癌细胞的植入,但定期注射AMD3100组的小鼠的骨转移灶负荷小于对照组。结论:SCLC骨转移灶中癌细胞定位于HSC niche,这一特殊微环境可以为癌细胞提供“保护伞”,使其免受免疫攻击和化疗药物的杀伤作用。在SCLC细胞向骨组织转移的过程中SDF-1发挥着至关重要的作用,在体外实验,SDF-1可以促进SCLC细胞进入G0期以抵抗饥饿的培养环境,还能够增强其侵袭和粘附的能力,CXCR4拮抗剂AMD3100可以抑制SDF-1促进SCLC侵袭的作用;在体内,AMD3100还能有效抑制骨转移灶的肿瘤负荷。此外,我们还发现,成骨细胞分泌SDF-1诱导表达CXCR4和/或CXCR7的癌细胞向骨组织迁移,同时SBC-5通过高表达CXCR7內吞SDF-1来降低原发灶中SDF-1的浓度,使其能够脱离原发灶,向表达有SDF-1的器官转移。这些发现提示我们SDF-1/CXCR4信号轴有望成为治疗SCLC骨转移的新靶点。