对于生物样品、环境样品以及药物中的痕量活性成分的分析，由于待分析物的含量通常很低，且样品基质较为复杂、干扰物质相对较多，因而仅依靠采用较高灵敏度的检测方法并不能完全改善待测物质的检出限，若加之采用良好的样品前处理技术对待测物质进行分离、纯化及富集，才可以减少基质成分对色谱系统的干扰，并且能够大大地提高检测方法的灵敏度和准确度。因此，建立良好的样品前处理方法，对待测物质进行纯化、富集，以获得快速、简便、高灵敏度的检测方法成为了本文的研究重点。传统的样品前处理技术，如液-液萃取（LPE），不仅操作繁琐费时，且需使用大量对人体和环境有毒、有害的有机溶剂，难以实现分析操作的自动化，其应用受到了很大限制。现阶段，开发高效省时、有机溶剂用量少的新型样品前处理技术，已成为药物分析领域新的热点课题。固相微萃取（SPME）、悬滴液相微萃取（SD-LPME），均是近些年发展的新型微型化的萃取技术，但SPME成本高、易产生交叉污染，而SD-LPME的悬滴容易脱落或发生损失，则可导致重现性差。因此，建立快速、廉价、选择性高的样品前处理方法用于微量物质的分析检测是十分必要的。中空纤维液相萃取（HF-LPME）是近年来快速发展的另一种微萃取技术，与上述前处理方法相比， HF-LPME不仅具有富集功效，且使用微量有机溶剂，克服了传统的样品前处理操作繁琐、费时，需大量使用有机溶剂等缺点，已广泛应用于简单样品基质的前处理过程中。然而，采用HF-LPME对复杂的生物样品进行分析的研究仍处于尝试阶段。雌激素及具有雌激素活性的物质可模拟机体内源性雌激素的生理、生化作用，具有拮抗内源性雌激素的效应，因此被称为环境雌激素。这些外源性化学物质进入体内后，干扰体内雌激素的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，造成内分泌系统的功能紊乱，破坏机体内环境的稳定，甚至可导致生殖障碍、发育异常、代谢紊乱以及某类癌症的发生，因此该类物质与某些疾病发生机制之间的关系已引起医学界的广泛关注。牛奶中的雌激素正是环境雌激素的一种，由于近些年来，奶牛饲养方式的改变，牛奶消费量不断增加，牛奶中的雌激素水平也随之升高，且在体内不易降解，因此对人类健康的潜在危害性也越来越大。食物源性雌激素主要为雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3），而雌二醇约占40%，因此，牛奶中E2的检测对于监控奶制品的食用安全是极其重要的。采用HPLC-UV分析牛奶中的雌激素，检测水平仅10-6左右不能较好的满足痕量雌激素的检测，而灵敏度较高的质谱（MS）检测器价格昂贵并不能迅速普及。因此，本课题研究建立了HF-LPME与HPLC-UV联用的方法用于牛奶中E2的分析。所建HF-LPME对牛奶中E2的富集倍数可达200倍，即使采用普通的HPLC-UV，其分析水平便可达到10^-9，大大的提高了分析方法的灵敏度,可用于牛奶中的E2含量分析。已有文献证实，体内E2、E1及其代谢产物水平与乳腺癌、子宫内膜癌等癌症的发生密切相关。然而，由于机体内E2、E1的代谢产物含量极低，常用的分析手段无法胜任，即使采用HPLC-MS，其分析灵敏度仍然不能完全满足分析要求，严重制约了雌激素及其代谢产物水平与癌症发生机制的研究，因此，开发具有高灵敏度的分析方法，是雌激素代谢产物研究的关键问题。本课题将高灵敏度的UPLC/MS分析方法结合丹酰氯衍生，进一步提高了雌激素代谢产物分析的灵敏度，同时结合具有富集作用的HF-LPME样品前处理技术，建立了高灵敏的分析雌激素代谢产物的新方法，成功分析了尿样中8种雌激素及其代谢产物的含量。该方法检测灵敏度可达10^-14，加之采用MRM检测模式，不仅干扰少，灵敏度高，且分析时间短、操作相对简单。20例待检子宫内膜癌患者尿样检测结果与20例健康志愿者尿样检测结果研究表明，5种雌激素代谢产物在子宫内膜癌患者与健康人尿样中的含量存在显著性差异，进一步证实了雌激素及其代谢产物含量水平与子宫内膜癌发生机制之间的关系。所建分析方法为临床雌激素及其代谢产物的研究提供了可靠的分析手段。HF-LPME对生物样品中雌激素及其代谢物的分析，提高了检测灵敏度，展现了其分析复杂基质中痕量、限量待测物质的应用前景，因此也可用于生物样品中某些违禁药物的限量检测，也可用于研究某特殊人群的用药史追溯等领域。麻黄碱类物质是一种具有兴奋作用的限用药品。伪麻黄碱与麻黄碱互为非对映异构体，对人的中枢系统具有兴奋的作用[1]，是感冒药中的常见成分。由于其具有较强的兴奋作用，在体育赛事中会影响竞赛的公平，因此对于赛前运动员，该类药物的使用是有所限制的。此外，该类药物与抗组胺药合用会产生嗜睡、疲倦、头昏等副作用，对于飞行员等特殊群体该类药物也需谨慎服用，FAA（Federal Aviation Administration）中规定该麻黄碱类药物不得与抗组胺药合用，以避免不良反应所致的空中事故发生。因此，建立高效、快速的生物样品中痕量麻黄碱分析方法，用于追溯特殊人群的用药史，对于药物的安全使用具有重要意义。本课题采用了三相HF-LPME建立了尿样中伪麻黄碱的分析方法，所建方法对尿样中的伪麻黄碱的富集倍数达220倍，用HPLC分析，其分析灵敏度高达10-9，能够检测服用氨酚伪麻美芬片后10h的尿样；若采用HPLC-MS，其分析灵敏度高达10-12，可对服药72h后尿样中的伪麻黄碱进行满意的检测分析。与相关文献报道比较，该方法提高灵敏度，延长了检测周期，更加适用于该类药物的监测和用药历史的追溯。该方法还成功地应用于尿样中麻黄碱和伪麻黄碱的同时检测分析，为该类药物的检测分析提供了新型、准确、灵敏的分析平台，为有效地监控该类药物使用情况及特殊人群的合理用药提供了新的分析手段。第一部分中空纤维两相微萃取技术用于雌激素及其代谢产物的分析研究一、中空纤维液相微萃取-高效液相色谱联用分析牛奶中痕量雌二醇目的：建立中空纤维液相微萃取-高效液相色谱（HF-LPME-HPLC）联用的方法，用于分析检测牛奶中痕量的雌二醇的含量。方法：采用自制的HF-LPME装置，考察并优化了影响HP-LPME的因素，以100μL正辛醇作为萃取溶剂，在室温600rpm搅拌速度下萃取1h；色谱条件为：采用Kromasil C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水（80:20，v/v），流速为1.0mL·min^-1，检测波长280nm进样量20μL直接进样分析。结果：牛奶中雌二醇的富集倍数可达200倍。雌二醇在1.00～125ng·mL^-1范围内线性关系良好（R=0.9985），最低检出限0.571ng·mL^-1，平均回收率分别为96.4%、98.7%、98.1%。结论：所建立的HF-LPME-HPLC方法将牛奶中雌二醇的检测灵敏度提高至10^-10水平，该样品前处理方法简单、成本低，且环境友好，适用于痕量雌二醇的分析检测。二、HF-LPME-UPLC/MS研究尿样中8种雌激素及其代谢物含量与子宫内膜癌发生机制间的关系目的：建立HF-LPME-UPLC/MS并结合丹酰氯衍生测定痕量雌激素代谢产物的高灵敏度分析方法，用于分析子宫内膜癌患者与健康志愿者尿样中8种雌激素及雌激素代谢产物的关系。方法：待检尿样采用NaOH溶液高温煮沸进行化学破坏后，将pH调至3，以正辛醇为萃取溶剂，在室温600rpm转速下萃取1h；取出萃取液于90℃下氮气吹干，加入pH为9.0的缓冲盐溶液100μL溶解，以100μL丹酰氯为衍生试剂，在60℃下衍生5min，取反应液10μL进样分析。UPLC/MS检测条件：AQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm;2.1mm×50mm），以A:水（0.1%甲酸）、B:乙腈（0.1%甲酸）为流动相，按0min–60%B,6min–92%B,7⁸min–60%B的方式梯度洗脱，在正离子的MRM模式待测物质的检测离子对分别为E1（504.2/171.1）、 E2（506.1/171.0）、2-OHE1（753.1/170.1）、16α-OHE1（520.0/171.2）、2-OHE2（755.1/170.0）、4-OHE2（506.1/171.0）、2-MeOE1（506.1/171.0）、2-MeOE2（506.1/171.0）和IS（506.1/171.0）。结果：实验结果表明， HF-LPME对尿中8种待测物质的富集倍数约180倍，8种雌激素及其代谢物在0.01～1.0ng·mL^-1范围内线性关系良好（R均大于0.9914），最低检测限为5×10-5ng·mL^-1，加样回收率在89.7%¹06.2%范围内。结论：本课题将高灵敏度的UPLC/MS分析方法结合丹酰氯衍生，同时结合具有富集作用的HF-LPME样品前处理技术建立了高灵敏的分析雌激素代谢产物的新方法，该方法的检测灵敏度可达10^-14，成功分析了尿样中痕量的雌激素代谢产物。20例待检子宫内膜癌患者与20例健康志愿者尿样检测结果研究表明，5种雌激素代谢产物在子宫内膜癌患者与健康人尿样中的含量存在显著性差异，初步证实了雌激素及其代谢产物含量水平与子宫内膜癌发生机制之间的关系。所建分析方法为临床雌激素及其代谢产物的研究提供了可靠的分析手段。第二部分：中空纤维三相微萃取技术用于尿中麻黄碱类物质的分析研究一、中空纤维三相微萃取与HPLC及LC-MS联用同时分析人尿液中盐酸伪麻黄碱的含量目的：建立中空纤维三相微萃取与HPLC及LC-MS联用的高灵敏度的分析方法用于分析人尿液中痕量伪麻黄碱。方法：采用HF-LPME装置，优化后的萃取条件为：样品溶液的pH为11，中空纤维壁上的有机相为正辛醇，以50μL盐酸溶液（pH=2）为接受相，NaCl离子强度为30%，在室温下萃取60min，取萃取液直接进样分析。HPLC分析条件：色谱柱为KROMASIL C18柱（150mm×4.6mm,5μm），流动相为水(含10mmol·L^-1KH2PO4、10mmol·L^-1三乙胺，用H3PO4调pH至4.0)：乙腈（92:8），检测波长为210nm，进样量为10μL。LC-MS检测条件：色谱柱为KROMASIL C18柱（150mm x4.6mm,5μm），流动相为水(含10mmol·L^-1CH3COONH4，10mmol·L^-1三乙胺，HCOOH调pH至4.0)：甲醇（40:60），采用正离子条件MRM模式，检测离子对为m/z166.1^-148.1，进样量为20μL。结果：实验结果表明，HF-LPME对尿中伪麻黄碱的富集倍数约220倍，采用HPLC检测时，其线性范围为5.0×10-3～1.0μg·mL^-1，相关系数r大于0.9957，检出限为2.0×10-3μg·mL^-1，加样回收率为92.8～97.2%，RSD均不高于9.7%。采用LC-MS检测时，在2.0×10-3⁰.50μg·L^-1范围内线性关系良好，检测限为1.0×10-6μg·mL^-1。结论：本文所建方法提高了尿样中伪麻黄碱分析灵敏度，检测结果表明采用HPLC分析，其分析灵敏度高达10-9，能够检测服用氨酚伪麻美芬片后10h的尿样；若采用HPLC-MS，其分析灵敏度高达10^-12，可对服药72h后尿样中的伪麻黄碱进行满意的检测分析。该方法有效地延长了伪麻黄碱类药物的检测周期，更加适用于该类药物的监测和用药历史的追溯。二、中空纤维液-液-液微萃取分析人尿液中麻黄碱和伪麻黄碱目的：建立HF-LPME-HPLC联用的高灵敏度的分析方法用于人尿液中的痕量麻黄碱和伪麻黄碱的含量测定。方法：采用中HF-LPME装置，优化后的萃取条件：尿样溶液的pH为11，中空纤维壁上的有机相为正辛醇，以50μL盐酸溶液（pH=2）为接受相，NaCl离子强度为30%，在室温下以800rpm的转速萃取60min。HPLC检测条件：色谱柱为Kromasil C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-20mmol·L^-1磷酸二氢钾溶液(加入10mmol·L^-1三乙胺，磷酸调pH3.0±0.02)（4:96），检测波长：210nm，进样量为10μL，流速为1.0mL·min^-1，柱温为30℃。结果： HF-LPME对尿样中麻黄碱和伪麻黄碱的富集倍数约为200倍；麻黄碱和伪麻黄碱的线性范围分别为0.01～5μg·mL^-1，5.0×10-3～0.75μg·mL^-1，相关系数r2分别大于0.9982、0.9978，检出限分别为0.005、0.002μg·mL^-1。结论：所建HF-LPME-HPLC方法提高了尿样中麻黄碱和伪麻黄碱的分析灵敏度，采用HPLC检测手段其分析灵敏度高达10-9，能够检测服用急支糖浆后5h的尿样。该方法有效地延长了伪麻黄碱类药物的检测周期，更加适用于该类药物的监测和用药历史的追溯。