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本文针对罗布麻分枝多造成纤维短、产量低等难题,研究克隆了其分枝相关基因CUC3(Cup-Shaped Cotyledon3)的保守区,并转化了罗布麻和烟草,为通过转基因技术控制罗布麻分枝奠定了基础。主要研究结果如下:
研究了罗布麻愈伤组织的诱导和分化。在16h/d光周期,对真叶和茎愈伤诱导最合适的培养基是MS附加0.5mg/L6-BA和1.0mg/L NAA;真叶和茎愈伤组织的生长周期均为30d,但茎愈伤组织细胞生长速度较快;再分化诱导发现,罗布麻愈伤组织对激素诱导不敏感,不容易分化产生再生芽。
发根农杆菌对罗布麻的根外植体的发根诱导率达到80%以上;Rl000感染的根外植体适合黑暗环境培养。在无激素的1/2MS培养基上,LBA9402和R1601诱导的发根可生成再生芽,诱导率为10%,在附加0.2mg/L IBA的1/2MS培养基上2周内成根。PCR对发根及再生植株鉴定,证明T-DNA插入了植物基因组。
通过RT-PCR分别克隆了罗布麻和烟草CUC3基因的保守区cDNA,二者序列同源性达到98%。PCR鉴定、酶切和测序分析表明,正确构建了CUC3基因的反义和RNA干扰载体。用冻融法将表达载体转化农杆菌,PCR检测得到阳性克隆。
农杆菌分别转化烟草和罗布麻。烟草叶片在分化培养基(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+50mg/L Hyg+500mg/L Cb)上4周后分化出芽;在生根培养基(MS+0.2 mg/L IBA+500mg/L Cb)上,2-3周后形成根;叶片GUS(β-葡萄糖甘酸酶)组织化学染色,阳性率为75%;通过PCR检测HPT基因(潮霉素磷酸转移酶基因)的DNA序列,获得30个阳性株系。半定量RT-PCR检测发现CUC3基因的表达量明显降低。在烟草转化阳性株系中获得5种表型:叶片融合,叶片卷曲,叶片缺失,叶片背腹特征不明显及分枝减少。罗布麻转化后,尚未获得再生植株。