第一部分抗人胃癌干细胞功能性单抗的筛选鉴定胃癌在我国发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第二位,一直对人类生命健康造成严重威胁。导致胃癌高死亡率的根本原因是手术、放疗、化疗后仍发生高比例的转移、复发,且发生转移复发的胃癌几乎都耐药。然而,现有的临床治疗手段对转移复发后的胃癌疗效甚微,胃癌死亡率多年来仍旧居高不下。近年来,有关肿瘤干细胞的最新研究表明,肿瘤干细胞是造成肿瘤转移、复发、耐药的根本原因。因此,靶向肿瘤干细胞治疗肿瘤转移、复发、耐药的新策略,有望降低肿瘤死亡率,成为当今肿瘤研究的新热点。目前尚未见到有关靶向胃癌干细胞治疗的研究报道。本课题研究旨在筛选鉴定获得能靶向胃癌干细胞的功能性单抗,通过体内、外功能研究证明功能性抗体靶向胃癌干细胞能有效治疗胃癌,从而为治疗胃癌的转移、复发、耐药提供有应用价值的后续抗体前药。本实验在前期研究中,从人胃癌组织中分离含有肿瘤干细胞的胃癌细胞,免疫小鼠后,采用本室建立的大容量功能性单抗库技术制备了库容3120个克隆的杂交瘤单抗库。在此基础上,本研究首先采用活细胞ELISA技术筛选该单抗库3120个克隆的杂交瘤上清,获得了482株能同时与胃癌细胞SNU-5和BGC-823两种胃癌细胞膜反应阳性的杂交瘤克隆。为了获得抗人胃癌干细胞的单抗,采用含肿瘤干细胞比例高的SNU-5 Sphere细胞进行活细胞ELISA法复筛482株阳性单抗,结果显示其中144株单抗上清与SNU-5 Sphere细胞的结合反应的OD值(0.5-1.2)显著高于亲本细胞(0.2～0.4),表明这些单抗可能是抗人胃癌干细胞单抗。为了进一步确定这些单抗是抗人胃癌干细胞单抗,我们采用无血清甲基纤维素成球抑制实验检测了144株单抗能否抑制肿瘤干细胞自我更新能力的成球生长的功能。结果发现,其中64株单抗能不同程度地抑制SNU-5中肿瘤干细胞的成球生长,抑制率达10-52%,证明这64株单抗不仅是抗人胃癌干细胞的单抗,而且可能是还具有抑制胃癌干细胞功能的功能性单抗。为了进一步验证64株单抗是抗人胃癌干细胞的功能性单抗,我们从64株候选单抗中挑选了10株单抗在2种胃癌干细胞模型中,采用流式活细胞免疫荧光、无血清甲基纤维素成球抑制、活细胞ELISA单抗技术进行了进一步鉴定。结果发现,10株单抗的阳性细胞在胃癌Sphere细胞中的比例升高,均有不同程度富集,表明这些单抗具有肿瘤干细胞自我更新能力。同时发现10株单抗与胃癌干细胞标志物CD90、CD44阳性的胃癌干细胞均有不同比例的共染,且共染阳性细胞的比例在Sphere细胞中都明显富集(1.3-31.4倍),表明10株单抗均能识别人胃癌干细胞并与之呈阳性反应,证实这些单抗都是抗人胃癌干细胞的单抗。成球抑制实验结果表明10株单抗对2种胃癌细胞的干细胞均有不同程度的抑制作用,抑制率达16.3-45.2%。是具有功能的胃癌干细胞单抗。至此,我们至少筛选鉴定获得10株抗胃癌干细胞的功能性单抗。第二部分抗人胃癌干细胞单抗25G5的研究在前面10株抗人胃癌干细胞单抗研究结果中发现,其中单抗25G5在胃癌Sphere细胞中的阳性比例高(17.1%),富集倍数也高,与人胃癌干细胞标志物CD90、CD44共染比例最高、富集比例最高(31.4倍)。抑制人胃癌干细胞成球的功能性也最好(抑制率达31.3～45.2%),这些结果表明25G5单抗在10株单抗中,肿瘤干细胞特性最强,抑制胃癌干细胞功能最强。因此,我们选择25G5单抗进行肿瘤干细胞特性、体外功能及体内靶向人胃癌干细胞治疗胃癌的系统研究。通过无血清扩大培养25G5单抗杂交瘤,收集上清,采用Protein G亲和纯化法,从无血清上清中纯化25G5单抗。首先,我们对25G5单抗识别结合的阳性细胞的肿瘤干细胞特性进行了检测分析。已有的研究证明肿瘤干细胞具有很强的自我更新、高侵袭、耐药能力以及体内高致瘤性等特征。采用双色活细胞免疫荧光检测,发现25G5单抗识别的抗原与人胃癌干细胞标志物CD90、CD44均共表达共定位于人胃癌干细胞膜上,证明25G5单抗是抗人胃癌干细胞单抗。采用流式分选技术,分选25G5+、25G5-和假分选细胞,检测分析在无血清培养基的成球率表明,25G5-细胞的成球率(21.4%)显著高于25G5-细胞(12.3%)和亲本细胞(16.1%),P值<0.05,表明25G5单抗阳性细胞具有较强的肿瘤干细胞自我更新能力。用流式分选细胞进行的Transwell细胞侵袭实验、耐药实验,结果表明,25G5+细胞的侵袭能力(244.5)较25G5”细胞(122.4)和亲本细胞(143.2)显著增强。25G5+细胞对顺铂化疗药的耐药性(IC50 0.285μg/ml)较25G5-细胞(IC50 0.094μg/ml)和亲本细胞(IC50 0.155μg/ml)显著升高。鉴于肿瘤干细胞体内高致瘤性是评价肿瘤干细胞的金标准,我们将细胞接种裸鼠体内观察其致瘤性,发现25G5-细胞的致瘤性较25G5-细胞高50倍以上,较亲本细胞高25倍以上。以上这些研究结果证明25G5单抗识别的细胞是人胃癌干细胞,具有肿瘤干细胞的所有特征。即25G5是识别人胃癌干细胞的单抗。采用无血清甲基纤维素成球抑制,Transwell细胞侵袭和细胞耐药等实验在两种人胃癌干细胞模型中系统研究了25G5单抗的体外功能。结果显示,25G5单抗在0.125mg/ml-2mg/ml的抗体浓度下对SNU-5细胞中干细胞的成球生长均有抑制作用,其抑制率为22.8～46.4%(P<0.05),且有明显的抗体剂量依赖关系。同样对BGC-823胃癌细胞中的干细胞的成球生长抑制率为17.542.5%。表明25G5具有显著抑制胃癌干细胞自我更新能力的功能。Transwell侵袭实验的结果显示,25G5单抗对含有高比例胃癌干细胞的SNU-5的Sphere细胞的侵袭功能有明显的抑制作用,抑制率为26.658.4%(P<0.05)。细胞耐药实验的结果显示,25G5单抗能显著降低人胃癌干细胞的耐药性,且有明显抗体剂量相关性,在抗体浓度达到1mg/ml时,干细胞的耐药性下降约1.3倍(IC50值由0.341 μg/ml下降至0.153μg/ml)。以上这些结果证明25G5单抗能显著抑制人胃癌干细胞的自我更新、侵袭和耐药的功能,是一株抗人胃癌干细胞的功能性单抗。为了探讨25G5单抗在体内靶向胃癌干细胞能否有效治疗人胃癌,我们用纯化的25G5单抗进行体内靶向裸鼠移植瘤的动物试验研究,为了科学评价结果,我们首先建立了适合25G5单抗的含有高比例胃癌干细胞的自发性高肺转移的动物模型SNU-5-V13。将SNU-5-V13的Sphere细胞接种裸鼠前肢腋下的皮下后,再经腹腔注射25G5抗体药物进行治疗。动物试验设9组,每周治疗2次,共计治疗10次。其间观察测定记录肿瘤体积描绘肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长体积的抑制率和P值。综上所述,本研究从3120个克隆的胃癌单抗杂交瘤库中筛选获得了64株抗人胃癌干细胞单抗,初步证明有10株单抗是具有抑制胃癌干细胞功能的功能性单抗,挑选其中的1株单抗25G5进行的系统性研究证明,25G5单抗识别的阳性细胞具有较强胃癌干细胞干性特征,确实是一株抗人胃癌干细胞的单抗,同时该单抗还能显著地抑制胃癌干细胞的自我更新、高侵袭、高耐药的体外功能,体内靶向胃癌干细胞能有效治疗小鼠的人胃癌移植瘤,具有开发为靶向胃癌干细胞治疗胃癌的抗体靶向药物的应用潜力。