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目的:探索达沙替尼和槲皮素通过清除衰老细胞对放射性溃疡的治疗作用。方法:1、本研究首先分析了人口腔粘膜基因数据库GSE103412中放射与衰老及衰老相关基因表达量的相关性;2、分别建立小鼠放射性口腔粘膜炎和大鼠放射性皮肤溃疡的模型:小鼠放射性口腔粘膜炎模型采用局部分次辐照(6 Gy/天),连续辐照5天,分别于开始辐照后第3、6、8、10天取小鼠舌组织;大鼠放射性皮肤溃疡模型采用单次大剂量辐照40 Gy,分别于辐照后第5、8、11、15天取大鼠右后肢;通过HE染色分析小鼠口腔粘膜及大鼠皮肤组织的结构变化、通过免疫组化检测其周期阻滞相关蛋白p16的表达、通过qRT-PCR检测其衰老及衰老相关分泌表型基因的表达情况。3、评估达沙替尼和槲皮素对放射性溃疡的疗效,将15只小鼠/大鼠随机分为三组(每组各5只):未辐照组、辐照组和DQ组,小鼠在辐照及给药第10天取舌组织,甲苯胺蓝染色并拍照;大鼠在辐照及给药第15天取右后肢并拍照,HE染色分析小鼠口腔粘膜及大鼠皮肤组织的结构变化、通过免疫荧光检测其γ-H2AX和Ki67蛋白的表达、免疫组化检测其P16蛋白的表达、qRT-PCR检测其衰老及衰老相关分泌表型基因的表达情况。4、建立细胞衰老模型:将HOK和人成纤维细胞暴露于8Gy的辐照下,辐照后第7天收集细胞及上清,通过SA-β-gal染色观察细胞是否衰老,qRT-PCR检测细胞衰老相关基因的表达量,ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎症相关细胞因子的表达情况。将收集的正常年轻细胞上清液和衰老细胞上清液分别培养年轻的HOK和人成纤维细胞,SA-β-gal和qRT-PCR检测培养的细胞是否衰老,以探讨衰老细胞是否对邻近细胞具有促进衰老的作用;蛋白印迹实验(Western Blot,WB)检测细胞p-JAK1和p-JAK2蛋白的表达情况,用vehicle和JAKi处理衰老细胞后分别收集上清液用于共培养年轻的HOK和人成纤维细胞,qRT-PCR检测细胞中炎症相关基因的表达。5、将HOK和人成纤维细胞分为未辐照对照组、未辐照DQ组、辐照对照组和辐照DQ组,辐照后药物DQ处理24小时,用流式细胞术检测细胞凋亡水平、钙黄绿素染色观察其细胞凋亡情况、WB检测凋亡相关蛋白的表达情况。6、将CAL27和MCF7细胞分为未辐照对照组、未辐照DQ组、辐照对照组和辐照DQ组,辐照后药物DQ处理24小时,用流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期分布、单细胞克隆实验检测其增殖能力和集落形成能力。结果:1、数据库GSE103412进行热图的分析结果表明放射治疗后CDKN2A(p16)、TP53和SASP相关基因的表达量明显增高;2、辐射建模后对不同时间点舌组织和皮肤组织HE染色结果显示,与正常上皮形态相比,随着时间的推移,辐照后舌组织上皮层逐渐变薄,缺损破坏,第10天形成溃疡;皮肤组织HE结果表明随着时间的推移,皮肤结构变得紊乱、炎症细胞浸润、最终形成溃疡;这些结果表明小鼠放射性口腔粘膜炎和大鼠放射性皮肤溃疡的模型构建成功;其中,免疫组化染色结果表明,相比未辐照时,辐照后不同时间点的舌组织和皮肤组织的p16蛋白的表达明显增高,qRT-PCR检测发现辐射后舌组织和皮肤组织中衰老基因(p16、p21、PAI-1)和衰老相关分泌表型基因的表达明显增高。3、甲苯胺蓝染色结果表明DQ几乎完全阻止了辐射后小鼠口腔粘膜炎的出现,HE结果发现经DQ处理的小鼠舌组织上皮层完整且连续,并且DQ减少了辐射诱导的皮肤溃疡;免疫荧光结果发现相比辐照组,DQ处理的小鼠舌组织和大鼠皮肤组中γ-H2AX蛋白的水平明显降低,而Ki67蛋白的表达明显增高;qRT-PCR检测发现相比辐照组,DQ组明显降低了小鼠舌组织和大鼠皮肤组织中衰老和衰老相关分泌表型基因的表达。4、相比正常年轻的HOK和人成纤维细胞,SA-β-gal检测观察到辐照后的HOK和人成纤维细胞大量被染蓝,qRT-PCR检测结果显示辐照后衰老基因的表达显著增高,ELISA结果表明辐照后细胞上清液中炎症相关细胞因子的表达增多,以上结果均表明辐射诱导的细胞衰老模型构建成功;共培养实验探索衰老细胞是否对邻近细胞具有促衰老的作用,相比正常上清共培养,与衰老细胞上清共培养后的正常细胞中SA-β-gal检测结果显示被染蓝的衰老细胞明显增多,qRT-PCR显示衰老和衰老相关分泌表型的基因表达量增高;WB检测结果表明辐照后衰老细胞的p-JAK1和p-JAK2蛋白的表达增高;与vehicle处理的衰老上清液共培养相比,经JAKi处理的衰老细胞的上清液共培养后的年轻HOK和人成纤维细胞的qRT-PCR检测结果显示炎症相关基因的表达降低。5、流式细胞术检测结果表明DQ可清除40-60%的衰老的HOK和10-20%的皮肤成纤维细胞,而DQ对年轻的HOK或皮肤成纤维细胞凋亡水平无影响;钙黄绿素AM/PI染色观察到DQ引起衰老的HOK和成纤维细胞的细胞死亡明显增加;WB检测发现DQ引起衰老的HOK和成纤维细胞凋亡相关蛋白PARP和cleaved caspase 3的表达增多,caspase 3蛋白表达减少。6、流式细胞仪检测凋亡结果表明,无论是否暴露于辐照,DQ都可引起CAL27和MCF-7凋亡,辐照后细胞凋亡更多;同样,周期结果显示,DQ处理的辐照后的CAL27和MCF-7细胞的G1期阻滞的细胞增加明显;细胞克隆实验结果发现DQ处理的辐照后CAL27和MCF-7细胞的集落大小减小,集落数量明显减少。结论:1、衰老生物标志物在人类和动物放射性溃疡中积累;2、DQ清除衰老细胞可减轻放射性溃疡;3、衰老细胞可诱导邻近细胞衰老并且分泌SASP;4、DQ通过诱导细胞凋亡来清除衰老细胞;5、DQ可增强肿瘤细胞的放射敏感性。