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副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起猪的一种全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。该病目前对猪场的危害较大。神经氨酸酶是副猪嗜血杆菌一种潜在的重要毒力因子,本试验对Hps神经氨酸酶的理化特性和免疫原性进行了研究,研究内容如下：1、Hps神经氨酸酶的理化特性研究Hps神经氨酸酶的提取与纯化：分别对血清5型(Hps-5)和血清12型(Hps-12)菌株进行培养,收集菌体,经超声波破碎法提取神经氨酸酶粗酶,再对粗酶用硫酸铵盐析和Q Sepharose FF阴离子交换层析纯化,再经SDS-PAGE电泳和神经氨酸酶检测试剂盒进行鉴定。神经氨酸酶提纯物经SDS-PAGE电泳结果表明,Hps-5和Hps-12提取物均只有一条蛋白电泳带,其分子量约为100kD,提纯的Hps神经氨酸酶通过酶活性检测,Hps-5和Hps-12酶活性分别为375.9 unit/mg、377.9 unit/mg。结果表明,从Hps5和Hps-12菌株中提取到纯度高、活性好的Hps神经氨酸酶。Hps神经氨酸酶的理化特性：用检测试剂盒对不同pH值、温度和金属离子条件下的神经氨酸酶活性进行检测。结果表明：Hps-5和Hps-12血清型的神经氨酸酶理化特性相似,pH值为8.0和温度为30℃,是酶的最佳条件,以0.05mol/L的Fe2+、Cu2+和SDS对酶的抑制作用最强,神经氨酸酶活性基本消失,0.05mol/L浓度的Ca2+、Mg2+和EDTA对酶的活性影响也较大,表现出较强的酶活抑制性。2、副猪嗜血杆菌神经氨酸酶对小鼠免疫原性的研究两种纯化的Hps-5和Hps-12神经氨酸酶分别进行Western Blotting,结果显示两种神经氨酸酶均能与Hps的阳性血清出现较强的反应。分别用灭活的Hps-5,Hps-12全菌及其神经氨酸酶(NA-5,NA-12)与弗氏佐剂按1：1体积充分乳化,对小鼠进行免疫,共三次。分别在首免后0 d、14 d、28 d、42 d采血,用间接ELISA方法测定血清的抗体,结果首免后14d可检测到抗体,28d的OD4so吸光值可达1.2-2.0之间,42d的OD450吸光值仍可达1.4-1.9。通过MTT法检测神经氨酸酶对小鼠脾淋巴细胞增殖能力,其Hps-5和Hps-12的神经氨酸酶的转化率均为15%-22%。在最后一次免疫两周后,分别用同型菌株和异型菌株对其攻毒,NA-12免疫组对Hps-5菌株和Hps-12菌株的保护率均为66.7%,NA-5免疫组对Hps-5菌株的保护率为50%,对Hps-12菌株的保护率为66.7%。结果表明神经氨酸酶是Hps的主要免疫保护性抗原之一,为进一步研究Hps亚单位疫苗提供理论依据。