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第一部分miR-449a在骨关节炎软骨组织标本和对照组软骨组织标本中表达的差异性及相关性研究目的:骨关节炎(osteoarthritis,OA)在关节疾病的病因分析中占主要地位,也是老年人致残的主要因素,给全世界范围内带来了巨大的社会经济负担。OA的主要病理特征是:由关节软骨内软骨细胞外基质的合成代谢和分解代谢不平衡引起的软骨持续性丢失。miR-449a已被报道在多种疾病中发挥着重要的作用,鉴于其在OA病理机制中的作用还未得到彻底的阐述,故本部分实验首先研究miR-449a在OA进程中表达水平的变化规律。方法:我们首先使用膝关节骨关节炎的Kellgren-Lawrence(KL)分级评分系统对患者膝关节骨关节炎严重程度进行分级评价。其中正常人软骨组织样本收集10例;中期(KLIII级)OA关节软骨组织样本8例;晚期(KLIV级)OA关节软骨组织样本12例。通过qRT-PCR技术分析软骨组织中miR-449a样本表达水平,用统计学方法分析miR-449a在OA发生发展进程中的变化。结果:与正常软骨组织相比,miR-449a在OA软骨组织样本中的表达水平是明显上调的,其中晚期OA软骨组织样本中的miR-449a的表达水平最高。结论:miR-449a在OA软骨组织与正常软骨组织中的表达水平存在差异,并且这种差异和OA发生发展的进程有一定关系,进而提示我们miR-449a在OA的病理机制中可能发挥着重要的作用。第二部分miR-449a过表达在软骨细胞外基质代谢中的生物学作用目的:维持关节软骨细胞外基质正常代谢对于软骨功能的正常运行是至关重要的,软骨细胞外基质进行性降解是OA的主要病理特征。我们这一部分实验主要是探索miR-449a在软骨细胞外基质代谢中的作用。方法:我们使用人软骨肉瘤细胞(SW1353)代替正常人软骨细胞来探索miR-449a 的功能,使用 miR-449a 模拟物(mimic)和 miR-449a 抑制物(inhibitor)分别来实现过表达和降低miR-449a的表达水平。首先用qRT-PCR检测miR-449a mimic 和 miR-449a inhibitor 的过表达和抑制效应,然后用 qRT-PCR、western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测SW1353细胞的Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen)、蛋白聚糖(aggrecan)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(ADAMTS4)的产量。结果:qRT-PCR 结果表明:miR-449a mimic 和 miR-449a inhibitor 能够明显地分别促进和抑制miR-449a的表达水平。并且通过qRT-PCR、western blot和ELISA实验证实:miR-449a过表达能够明显促进MMP13和ADAMTS4的mRNA和蛋白的表达水平,从而抑制了 type Ⅱ collage和aggrecan的mRNA和蛋白的表达水平,而通过miR-449a inhibitor处理则会表现出相反的效应。结论:上述结果表明,在体外实验中,miR-449a过度表达能够促进SW1353细胞外基质的分解代谢水平,抑制细胞外基质的合成代谢水平,这种作用提示我们miR-449a在未来OA的治疗中可能作为一个靶点。第三部分miR-449a以GDF5基因为作用靶点促进软骨细胞外基质降解的研究目的:miRNA发挥其生理病理学作用是通过抑制其特异性靶基因而实现的,因此我们拟通过一系列实验验证miR-449a的下游特异性靶基因,并且证实该靶基因在miR-449a介导的软骨细胞外基质退变过程中的生物学作用。方法:我们首先通过生物信息学软件预测miR-449a可能的特异性靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测进行实验检测miR-449a与GDF5 mRNA之间的直接靶向关系,然后运用qRT-PCR检测软骨组织样本中的GDF5和miR-449表达水平之间的相关性,同时通过miR-449a inhibitor和靶向GDF5的干扰RNA(siGDF5)验证GDF5在miR-449a促进软骨细胞外基质降解中的作用。结果:我们通过双荧光素酶报告基因检测表明miR-449a能够直接靶向结合GDF5的3’-UTR,并且过量表达miR-449a或者抑制miR-449a的表达水平能够明显抑制或者促进GDF5的mRNA和蛋白表达水平。此外,我们发现GDF5和miR-449a在收集的软骨组织中的表达水平之间存在明显的负相关关系。这些结果表明miR-449a能够直接靶向抑制GDF5。我们通过进一步研究使用siGDF5有效地干预了 GDF5的表达水平,从而观察到抑制miR-449a表达水平促进SW1353细胞外基质合成代谢和抑制SW1353细胞外基质分解代谢是能够被抑制GDF5表达水平所逆转的。结论:这些结果提示我们,miR-449a在OA进展过程中的表达是上调的,其过量表达导致的SW1353细胞外基质进行性的降解是通过直接靶向抑制GDF5来实现的。