论文部分内容阅读
目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,以DJ-1为靶基因,设计构建DJ-1-shRNA真核表达载体,进行测序鉴定,通过转染SGC7901胃癌细胞,检测该表达质粒对SGC7901胃癌细胞DJ-1基因表达的影响,为进一步研究DJ-1是否参与胃癌细胞的侵袭迁移、建立动物模型研究胃癌腹膜转移的分子机制奠定前期实验基础。方法:利用GeneBank中人DJ-1基因序列(NM007262)作为分析序列,依据http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html上的设计原则,设计了靶向DJ-1基因的3条候选RNA干扰序列,与shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo构建重组质粒;同时设计并构建阴性对照RNA干扰重组载体,用于鉴定pGPU6/GFP/Neo质粒介导的RNA干扰体系的特异性,并对重组载体进行测序鉴定。将重组质粒转化Top10感受态大肠杆菌进行克隆,将克隆得到的重组质粒通过脂质体转染SGC7901胃癌细胞,采用RT-PCR,Western Blot法检测细胞中DJ-1mRNA和蛋白的表达。结果:重组质粒转化Top10大肠杆菌经氨苄青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。经测序分析证实,靶向DJ-1基因的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体及阴性对照RNA干扰重组载体构建成功,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-A,pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-B,pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C,pGPU6/GFP/Neo-shNC。RT-PCR法检测结果显示:pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C转染组瞬时转染后靶基因DJ-1表达的抑制效果最强达78%以上,第2组阴性对照重组载体转染后DJ-1基因的表达无明显变化(P<0.01);Westernblot法检测结果显示:pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C转染组瞬时转染后靶基因DJ-1表达的抑制效果最强达75%以上,第2组阴性对照重组载体转染后DJ-1基因的表达无明显变化(P<0.01)。结论:成功构建了DJ-1-shRNA真核表达载体,pGPU6/GFP/Neo-shDJ-1-C可明显抑制SGC7901胃癌细胞DJ-1基因的mRNA和蛋白水平的表达。