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本研究在体外条件下，以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型，通过谷氨酰胺(Glutamine，Gln)诱导热休克蛋白70(Heat shock protein70，Hsp70)上调表达，探究Hsp70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞机械屏障的保护作用及凋亡线粒体信号通路的调控作用，为明确其作用机制提供理论依据，并为其在畜牧业生产中的应用提供参考。
试验一、猪小肠上皮细胞热应激模型和Hsp70上调表达模型的建立
细胞热应激模型的建立。本试验将贴壁细胞置于42℃，5%CO2培养箱中分别培养0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h后，观察细胞形态，MTT法检测细胞活力。结果表明：当热应激时间为12h时，细胞存活率接近于50％，确定为后续试验热应激模型。
Hsp70上调表达模型的建立。本试验在细胞完全培养液的基础上分别添加浓度为1、2、4、6、8、10mmol/L的Gln后培养细胞24h，收集细胞，测定细胞中Hsp70蛋白及mRNA表达量。结果表明：Gln可诱导Hsp70高表达，经过6mmol/L的Gln诱导24h后，Hsp70表达量到达峰值(P＜0.05)，后续试验中Hsp70上调表达组选择6mmol/L浓度的Gln诱导Hsp70。
试验二、Hsp70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞机械屏障的保护作用
试验选取对数生长期的肠上皮细胞，将试验细胞分为Con组，Hs组和Gln组。Con组和Hs组加入完全培养液，Gln组加入含6mmol/LGln培养液在37℃CO2培养箱中培养24h后，Con组继续培养，将Hs组和Gln组细胞移入42℃CO2培养箱中培养，12h后分别收集三组细胞。①建立肠上皮细胞单层屏障模型，按照上述方法处理细胞，检测跨上皮电阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)及荧光黄透过率。②提取总RNA和总蛋白，用实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测Hsp70、Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白的相对表达量。结果表明：热应激和Gln均能显著诱导Hsp70的表达(P＜0.01)，Gln能进一步诱导细胞中Hsp70的表达。热应激状态下Hsp70上调表达对猪小肠上皮细胞膜通透性具有显著影响，TEER值显著升高(P＜0.01)，荧光黄透过率显著降低(P＜0.01)；Hsp70上调表达可显著提高热应激猪小肠上皮细胞中Occludin(P＜0.01)、Claudin-1(P＜0.01)、ZO-1(P＜0.01)蛋白及mRNA的表达水平。研究证实Hsp70的上调表达通过降低细胞膜通透性，升高细胞紧密连接蛋白的表达水平缓解肠上皮细胞热应激损伤，保护热应激猪肠黏膜机械屏障的完整性，进而维持肠黏膜屏障系统结构和功能。
试验三、Hsp70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞凋亡线粒体信号通路的调控作用
细胞处理同试验二，采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡水平，JC-1荧光标记法检测线粒体膜电位，Westernblot方法检测线粒体及胞浆中细胞色素C的含量，实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测Apaf-1，Caspase-9，Caspase-3，Bcl-2的mRNA及蛋白的相对表达量。结果表明：热应激状态下Hsp70上调表达对猪小肠上皮细胞凋亡具有显著影响，细胞凋亡率显著降低(P＜0.01)，线粒体膜电位显著升高(P＜0.01)，Cyt·C在线粒体中含量显著升高、胞浆中含量显著降低(P＜0.01)，抗凋亡因子Bcl-2表达水平显著升高，Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3蛋白和mRNA的表达量均显著降低(P＜0.01)。研究证实Hsp70的上调表达通过改善细胞凋亡线粒体通路相关因子的表达，提高线粒体膜电位，抑制Cyt·C从线粒体向胞浆的释放，使得线粒体信号转导通路诱导的细胞凋亡减少，从而达到降低热应激细胞损伤的作用。
试验一、猪小肠上皮细胞热应激模型和Hsp70上调表达模型的建立
细胞热应激模型的建立。本试验将贴壁细胞置于42℃，5%CO2培养箱中分别培养0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h后，观察细胞形态，MTT法检测细胞活力。结果表明：当热应激时间为12h时，细胞存活率接近于50％，确定为后续试验热应激模型。
Hsp70上调表达模型的建立。本试验在细胞完全培养液的基础上分别添加浓度为1、2、4、6、8、10mmol/L的Gln后培养细胞24h，收集细胞，测定细胞中Hsp70蛋白及mRNA表达量。结果表明：Gln可诱导Hsp70高表达，经过6mmol/L的Gln诱导24h后，Hsp70表达量到达峰值(P＜0.05)，后续试验中Hsp70上调表达组选择6mmol/L浓度的Gln诱导Hsp70。
试验二、Hsp70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞机械屏障的保护作用
试验选取对数生长期的肠上皮细胞，将试验细胞分为Con组，Hs组和Gln组。Con组和Hs组加入完全培养液，Gln组加入含6mmol/LGln培养液在37℃CO2培养箱中培养24h后，Con组继续培养，将Hs组和Gln组细胞移入42℃CO2培养箱中培养，12h后分别收集三组细胞。①建立肠上皮细胞单层屏障模型，按照上述方法处理细胞，检测跨上皮电阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)及荧光黄透过率。②提取总RNA和总蛋白，用实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测Hsp70、Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白的相对表达量。结果表明：热应激和Gln均能显著诱导Hsp70的表达(P＜0.01)，Gln能进一步诱导细胞中Hsp70的表达。热应激状态下Hsp70上调表达对猪小肠上皮细胞膜通透性具有显著影响，TEER值显著升高(P＜0.01)，荧光黄透过率显著降低(P＜0.01)；Hsp70上调表达可显著提高热应激猪小肠上皮细胞中Occludin(P＜0.01)、Claudin-1(P＜0.01)、ZO-1(P＜0.01)蛋白及mRNA的表达水平。研究证实Hsp70的上调表达通过降低细胞膜通透性，升高细胞紧密连接蛋白的表达水平缓解肠上皮细胞热应激损伤，保护热应激猪肠黏膜机械屏障的完整性，进而维持肠黏膜屏障系统结构和功能。
试验三、Hsp70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞凋亡线粒体信号通路的调控作用
细胞处理同试验二，采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡水平，JC-1荧光标记法检测线粒体膜电位，Westernblot方法检测线粒体及胞浆中细胞色素C的含量，实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测Apaf-1，Caspase-9，Caspase-3，Bcl-2的mRNA及蛋白的相对表达量。结果表明：热应激状态下Hsp70上调表达对猪小肠上皮细胞凋亡具有显著影响，细胞凋亡率显著降低(P＜0.01)，线粒体膜电位显著升高(P＜0.01)，Cyt·C在线粒体中含量显著升高、胞浆中含量显著降低(P＜0.01)，抗凋亡因子Bcl-2表达水平显著升高，Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3蛋白和mRNA的表达量均显著降低(P＜0.01)。研究证实Hsp70的上调表达通过改善细胞凋亡线粒体通路相关因子的表达，提高线粒体膜电位，抑制Cyt·C从线粒体向胞浆的释放，使得线粒体信号转导通路诱导的细胞凋亡减少，从而达到降低热应激细胞损伤的作用。