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烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种RNA病毒,具有广泛的寄主,不仅能感染烟草等茄科植物,使它们引起花叶病,还能感染310种以上其他植物,因此,研究者都在迫切寻找烟草花叶病毒病的防治方法。相对于一些化学药剂所带来的环境污染和易对作物产生药害等问题,探索天然产物用于烟草花叶病毒的防治,显然是一条可持续发展途径。近十多年来,不断有研究工作者发现植物或真菌提取物对TMV具有抗性。Y3是一种能够降低TMV侵染率的天然活性蛋白质,它是从真菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中提取出的,有研究表明Y3蛋白对TMV的外壳蛋白(TMV CP)有体外钝化的作用,使病毒蛋白不能顺利合成,从而达到抑制烟草花叶病毒的作用。已有研究通过酵母双杂交技术证明了Y3蛋白能与TMV CP在体外有相互作用,为进一步探究Y3蛋白与TMV CP是否在烟草细胞内有相互作用且寻找互作位点,本研究采用双分子荧光互补技术,首先将y3基因、TMV CP基因分别与双分子荧光互补载体pSPYNE(R)173、pSPYCE(M)相连,成功获得了融合表达载体pSPYNE(R)173-y3和pSPYCE(M)-CP,然后将他们分别转化入农杆菌GV3101中,利用渗透注射法导入烟草叶片下表皮细胞中,其后用激光共聚焦扫描显微镜观察到烟草细胞内有荧光信号,结果表明Y3蛋白与TMV CP在烟草细胞内发生了相互作用。为进一步研究Y3蛋白与TMV CP的互作位点,利用蛋白质序列分析软件分析Y3蛋白的相关功能结构域,发现其第23到26位氨基酸是CK2磷酸化位点,从而利用PCR介导的定点突变技术,将与荧光载体pSPYNE(R)173相融合的Y3蛋白的第23位丝氨酸(TCA)突变为丙氨酸(GCA),再将获得的突变体与融合载体pSPYCE(M)-CP共同导入烟草叶片下表皮细胞中,利用激光共聚焦扫描显微镜观察到仍有荧光信号,证明此位点的突变没有影响到Y3蛋白与TMV CP的相互作用,由此可判断该位点可能不是这两个蛋白的相互作用位点。以上结果表明,Y3蛋白与TMV CP在烟草细胞内有相互作用,然而单独突变CK2磷酸化位点并不能阻止Y3蛋白与TMV CP的互作,这为进一步研究其作用位点,了解Y3蛋白抑制TMV的作用机制奠定良好的基础。