急性肺损伤(ALI)是肺部在发生炎症的过程中,大量的中性粒细胞被招募进入肺部组织,导致肺部内皮细胞和上皮细胞损伤和凋亡的过程,最终机体出现血氧含量过低和严重的呼吸窘迫,严重时甚至会引起死亡。已有大量文献报道,胞外核苷酸(ATP、ADP、UTP、UDP)在炎症反应中,包括肺部炎症的发生过程中会有大量的释放,并通过其相应的P2ys受体家族促使细胞因子释放和免疫细胞趋化等作用,从而影响炎症的发生过程。基因芯片数据库显示,ALI小鼠肺组织中P2y6受体的表达有明显上升,而本实验室通过Real-time PCR技术对用LPS诱导的ALI小鼠肺组织的检测也得到了相似的结果。P2y6受体属于嘌呤类受体家族,其配体为胞外核苷酸UDP。有文献报道,P2y6受体在免疫细胞,包括中性粒细胞上都有较高的表达,但关于P2y6受体对于中性粒细胞的功能影响及调控机制都还无相关报道。中性粒细胞在ALI的发生过程中起着十分关键的作用,其能够通过直接的趋化作用、分泌细胞因子和趋化因子来招募更多的中性粒细胞浸润进入肺组织中,对肺部内皮和上皮细胞造成损伤并引起其凋亡,致使肺部呼吸功能的丧失,最终导致血氧含量过低和呼吸窘迫。基于中性粒细胞在ALI中的关键作用,本课题将探究在ALi的发生过程中,P2y6受体在其中的功能和调控机制。我们首先使用LPS刺激小鼠构建了ALI小鼠模型,然后通过Real-time PCR检测了P2y6受体在ALI小鼠肺组织中的表达情况。结果显示,相比正常小鼠,ALI小鼠肺组织中P2y6受体的表达有明显的上升；同时,通过荧光偏振检测发现其配体胞外核苷酸UDP也有大量的释放。随后利用本实验室构建的P2y6基因敲除小鼠,对同窝的野生型(WT)和P2y6-/-小鼠进行ALI模型的构建,并使用UDP对ALI模型小鼠进行激活处理。使用HE染色法对肺组织的形态进行了观察,通过Real-time PCR和ELISA方法对细胞因子的释放进行了检测。此外还利用流式细胞技术、MPO和免疫组化方法对免疫细胞的浸润情况进行了分析。实验结果表明,在P2y6受体被敲除后,ALI小鼠肺部细胞因子的释放和免疫细胞的浸润情况都有明显的减少,其中中性粒细胞浸润的降低最为明显。为了进一步研究P2y6受体如何影响小鼠ALI的发生,我们构建了骨髓WT和P2y6-/-嵌合体小鼠,并进行了ALI模型的构建,同样对肺组织的形态、细胞因子的释放和免疫细胞的浸润进行了检测。实验结果显示,当骨髓特异性敲除P2y6受体后,免疫细胞的浸润,尤其是中性粒细胞的浸润则呈现出非常明显的下降趋势。胞外核苷酸UDP激活P2y6受体的实验再次证明,P2y6受体能够引起免疫细胞,尤其是中性粒细胞的趋化作用,从而加剧了LPS诱导的ALI。为了更好地研究胞外核苷酸UDP通过P2y6受体对中性粒细胞功能的影响,我们体外分离了中性粒细胞,并通过R eal-time PCR 口ELISA方法检测了UDP和LPS对WT和P2y6-/-中性粒细胞释放细胞因子能力的影响。通过Transwell实验检测了UDP和fMLF对WT和P2y6-/-中性粒细胞趋化能力的影响,通过Western Blot实验检测了其中相关的信号通路。此外,还用FITC-鬼笔环肽标记UDP和fMLF趋化的WT和P2y6-/-中性粒细胞的细胞骨架F-actin并通过共聚焦显微镜进行了观察,以了解P2y6是否通过影响细胞骨架F-actin的变化来调控细胞的迁移能力。另外,通过构建中性粒细胞WT和P2y6-/-嵌合体ALI小鼠模型在体内验证UDP通过P2y6受体对中性粒细胞趋化能力的影响。这些体外、体内实验证明,在中性粒细胞中,胞外核苷酸UDP能够通过其表面的P2y6受体激活Erk信号通路,从而影响细胞骨架F-actin,进而增强中性粒细胞的迁移能力并最终加剧LPS诱导的ALI。综上所述,核苷酸UDP作为危险信号在ALI发生过程中被释放到细胞外,其通过中性粒细胞表面的P2y6受体激活细胞内的Erk信号通路从而改变细胞骨架F-actin,以增强中性粒细胞迁移至肺部的能力,最终加剧LPS诱导的ALI的炎症反应过程。本研究成果为寻找通过抑制中性粒细胞迁移从而抑制ALI的发生发展提供了一定的依据,也为相关药物的研发提供了重要的理论基础。