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罂粟(Papaver somniferum L.)作为一种药源植物,在医疗领域具有很高的应用价值。罂粟生物碱中含量最高、应用最广泛的是吗啡,但其易使人产生依懒性并成瘾。因此,寻求作用独特而且不使人产生依赖性的罂粟生物碱具有重要的研究意义。现今,罂粟吗啡合成代谢途径中产生的蒂巴因受到广泛关注,需求量日益增多。但自然合成蒂巴因的产率较低,使其利用效率和经济效益低下。因此,培育蒂巴因高含量的罂粟种质对医药发展具有重要的作用,并会产生巨大的社会价值。本研究根据罂粟体内吗啡生物合成的特点,克隆了吗啡代谢途径中的可待因-O-脱甲基酶基因(CODM)和蒂巴因-6-O-脱甲基酶基因(T6ODM),同时构建以关键酶基因为靶标的RNAi载体,最后在烟草中验证,为实现罂粟体内吗啡合成代谢途径中关键代谢酶基因的表达抑制、创造蒂巴因高含量的罂粟种质资源奠定基础。研究取得的结果主要有:1.根据已知的CODM(GenBank accession:GQ500141)和T6ODM(GenBank accession:GQ500139)编码序列,利用Primer5.0、Olig6.0软件设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到CODM和T6ODM基因的cDNA全长序列,与GenBank中注册的cDNA序列同源性在99%以上。2.通过E-RNAi网站在线分析,分别找出CODM和T6ODM基因的10个敏感靶点的长dsRNA片段,这些片段中含有较多的有效小干扰RNA[siRNA,19 nt],选择其中得分最高的片段作为构建干扰载体的目的片段。3.利用重叠PCR技术,将选择的靶标基因敏感片段融合,并在5′和3′端添加适合的酶切位点,以便插入到RNAi基础载体pHANNIBAL中。采用分步酶切和连接方法,将正向片段和反向片段分别插入到基础载体的PDK内含子两侧,得到中间载体pHACTFR。再将“Ca MV 35S P::正向融合片段::PDK内含子::反向融合片段::OCS T”插入含有草甘膦抗性基因的pCEPSPS载体的SacⅠ和PstⅠ之间,得到ihpRNAi载体pCEHACTFR。采用冻融法将载体pCEHACTFR导入农杆菌LBA4404菌株中,获得转化用的工程菌。4.采用真空渗透结合农杆菌介导方法转化烟草幼苗,对转化的烟草植株进行分子检测和除草剂抗性鉴定,获得的阳性烟草转化苗具有草甘膦抗性,说明所构建载体的LB和RB之间的除草剂表达单元和ihpRNAi单元已整合到烟草基因组中。5.通过对罂粟组织培养基配方、培养条件以及转化体系的研究,初步建立了罂粟的再生体系,筛选出适合罂粟再生培养的培养基以及农杆菌介导的转化体系。