背景原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC),是最常见的恶性肿瘤之一,现在全球发病率接近62.6万/年,死亡率接近60万/年,发病率居于全球恶性肿瘤的第五位,癌症的死因顺位位居第三位;而全球肝癌新发病例的一半以上在我国,据统计每年肝癌新发病例约30万,在癌症发病中居于第二位,癌症的死因顺位位居第二位;中国肝癌发病率以东南沿海最高,同全国相比,广东省肝癌死亡率高出全国平均水平50%,与全球相比,是全球平均水平的3～4倍。广东的3次大规模死因调查均提示,顺德地区居民恶性肿瘤死因顺位居于第一位即为肝癌。而肝癌起病隐匿,好发于中老年男性,男女之比为2:1-5:1,且病程短,疾病进展迅速,80%患者就诊时已处于癌症中晚期,失去了治疗的最佳时期,因而治疗效果不佳,病死率高,五年生存率仅在5%左右,严重影响我国居民的生命与健康。因此,在该地寻找和建立有效的预防和筛查方法,降低肝癌的发病率和死亡率,已成为当地最主要的公共卫生问题。目前可以确定的是,肝癌的发生是一个十分复杂的过程,是多个环境和遗传因素、多个基因参与和突变的结果,有多种风险因素参与肝细胞肝癌的致病起始,促癌作用和病情进展。目前已经证实乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染、血吸虫病、肝硬化、酗酒及摄入大量的黄曲霉素等是导致肝癌发生的重要原因,在我国,大部分肝癌患者有HBV感染史。但有相关的研究也表明,病人机体对HBV病毒的免疫能力存在着很大的个体差异,也就是说患者感染HBV病毒后,病情进展以及恶化程度取决于病人自身抗病毒的免疫中相关易感基因的多态性。而目前研究广东地区肝癌相关的易感基因多态性的相关分析数据非常少。在过去的数十年,对于人类基因与肿瘤发生关系的调查研究基本上都集中在结构基因及其相关的表达调控序列上,然而最近几年的研究表明人类基因的非编码序列对肿瘤生物学行为有至关重要的作用。曾被视为转录“噪声”的长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)近年来被证实在染色质重塑、组蛋白修饰、转录干扰、原癌基因活化等多个生物学进程中发挥关键调控作用,且相对于编码蛋白的基因,LncRNA在肿瘤中是非常精确且特异性表达的,这个特点让其成为新的肿瘤标记物非常有希望。于是LncRNA成为近年来肝癌等恶性肿瘤的病因学研究中的一个全新热点。已有研究证实许多LncRNA的异常表达与肝癌的发生、转移、预后或诊断密切相关。最近的研究发现,一些LncRNAs在MYC位点附近转录,且从多层面参与MYC的调控。8q24之前被认为是缺少蛋白编码基因的“基因沙漠”,位于8q24染色体区域的MYC原癌基因其上游区域的IncRNA被GWAS鉴定出很多独立的癌症可能位点,被认为是多种癌症(前列腺,卵巢和结肠癌)的高危险区域。而位于这个区域的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1基因已被证实和多种癌症的发病有关,且有的已作为某种特殊癌症非常有效的生物标记物。但是涉及这个个基因与肝癌的报道很少,仅有个别文献涉及CCAT1在肝癌中有高表达,且之前的研究的人群样本量较少,SNP位点不够全面,统计效能有限。综上所述,在广州顺德展开流行病学调查研究来阐明诱发肝癌的危险因素,采用基于单核苷酸多态性和单体型的研究策略,扩大样本量、应用病例对照及队列研究设计等分析性研究方法,深入开展LncRNA遗传多态性与恶性肿瘤易感性的研究,将有助于个体和群体罹患肝癌的风险的预测,而且对于阐明肝癌发生及发展机制有极为重要的意义,最终有助于提高肝癌的早预防、早诊断和早治疗的水平。为此我们开展此项研究。拟将人群流行病学、分子生物学、生物信息学和统计学方法有机结合,选择8q24区域的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、中的潜在功能性变异位点,深入开展LncRNA遗传多态性与肝癌易感性的研究,揭示对肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式,将有助于肝癌的病因学深入研究,以期为肝癌预测预警体系的构建提供遗传标志物,最终将有助于提高肝癌的早期预防、早期诊断和早期治疗的水平,对控制肝癌的流行、减轻肝癌的疾病负担有极为重要现实意义。目的筛选和预测位于8q24染色体上的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR15个LncRNA中的可疑位点,研究其候选基因SNP与原发性肝癌的易感性;同时揭示候选基因对原发性肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式,为进一步深入开展肝癌遗传易感机制研究提供科研依据。方法(1)按照病例对照研究策略,选取广东顺德人群中的619例肝癌病例和619例对照,进行流行病学问卷调查收集肝癌的环境及遗传因素信息,采用单因素logistic回归筛选其危险因素信息;(2)用Haploview软件以R2>0.8,MAF>0.05的标准,参考大量文献,结合生物信息学技术,运用SNP功能预测数据库筛选和预测CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1中的潜在功能性遗传变异位点;(3)采用硅胶膜吸附法进行研究对象血液的DNA提取,由博淼生物科技(北京)有限公司采用中通量MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术系统Sequenom进行SNP基因分型,计算其基因型及等位基因频率的分布,分析候选基因潜在功能区域的单核苷酸多态性;(4)对病例组及对照组SNPs进行Hardy-Weinberg平衡检验,采用卡方检验、logistic回归、单倍体分析等方法分析候选基因SNP与原发性肝癌易感性的相关性;(5)基于流行病学调查结果及SNP与肝癌易感性结果,采用条件logistic回归模型、叉生分析、多因子降维法(MDR)方法探索候选基因CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1对原发性肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式。结果1、研究对象共计1238例,病例组619人,对照组619人。男女比例为6.5:1,男性平均年龄为60±12岁,女性平均年龄为57±16岁。其中,肝癌患者平均首诊年为55±12岁,以50～70岁为主,占57.19%,72.05%患者有乙肝感染史,68.5%患者有慢性肝炎史,43.13%患者有肝硬化史,11.47者有肝吸虫感染史,68.98%患者吸烟,57.19%患者饮酒,24.88%患者食用生鱼,58.48%患者曾经饮用沟塘水,25.52%患者有乙肝家族史,14.54%有肝癌家族史,19.22%患者有肿瘤家族史。2、单因素条件Logistic回归分析得:乙型肝炎病毒感染、肝吸虫感染、吸烟、饮酒、有无进食鱼生史、是否饮用沟塘水、肝癌家族史、肿瘤家族史8个因素可能是原发性肝癌发病相关的危险因素。(P<0.05),其OR值和95%置信区间分别为:18.88(13.53-25.61)、3.15(1.46-4.77)、1.56(1.37-2.23)、1.62(1.22-2.06)、1.48(1.12-1.85)、1.68(1.34-2.16)、3.81(2.27-5.95)、1.76(1.23-1.97)。3、对选定23个候选基因采用Mass ARRAY技术分型,经HWE遗传平衡定律分析得:CCAT1 基因的 rs10087719、PVT1基因的 rs4733813、rs77290463差异有统计学意义(P<0.05)外,其余位点差异均无统计学意义(P>0.05)。对符合HWE遗传平衡定律的20个SNP位点的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的分布采用x2检验进行分析得:CCAT1中的rs6989575、PVT1中的rs13257657和rs13281615的基因型和等位基因频率分布在两组间差异具有统计学意义(χ2=11.5172,P=0.041,χ2=6.262,P=0.044,χ2=24.654,P=0.000),其他各SNP的基因型和等位基因频率分布均无统计学差异(P>0.05)。4、对20个SNP位点用条件logistic回归模型进行基因型关联分析,结果提示:rs13257657、rs13281615、rs6989575三个位点的基因型与肝癌发生风险有统计学关联(P<0.05,OR值均>1),提示这三个基因可能为肝癌的危险因素,经调整年龄、性别、乙肝病毒感染史、乙肝家族史等因素后,三个SNPs基因型与原发性肝癌发病的风险仍具有统计学关联(P<0.05,OR值均>1)。进一步的显性模型、隐性模型和加性模型的分析提示:rs13281615、rs6989575在显性模型有统计学意义(P<0.05,OR值>1),rs1 3257657在显性模型、隐性模型和加性模型有统计意义(P<0.05,OR值>1),而其他SNPs基因型与原发性肝癌发病风险均没有统计学关联(P>0.05)。对20个SNP位点的单倍体分析没有提示病例和对照组间有统计意义的单体型(P>0.05)。5、利用叉生分析表对每个基因的SNP位点进行交互作用分析,基于条件logistic回归模型,采用相乘和相加交互作用模型,并进而得出相应结论。结果显示:PVT1基因的rs13281615位点与CCAT1基因的rs77628730位点存在相乘和相交交互作用(P<0.05),CCAT1基因的rs6989575位点与CASC8基因的rs1562430位点存在相乘交互作用(P<0.05),其他各基因之间的交互作用模型均无统计学意义(P>0.05)。6、对 CCAT1 上的 rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的 rs10808556,PVT1 上的 rs13281615、rs13257657、CASC8 上的 rs1562430,PRNCR1上的rs13252298共8个基因与饮酒史、曾饮用沟塘水、乙肝病毒感染、肝吸虫感染史、肝癌家族史、肿瘤家族史、吸烟、食用生鱼共8环境因素分别进行基因-环境交互分析,结果提示:CCAT1基因中的rs7816475遗传变异与饮用沟塘水,乙肝病毒感染间存在交互作用(P=0.020,P=0.032),携带rs7816475 GG基因型的饮用沟塘水阳性者肝癌发病风险增加,OR值为1.513(95%CI=1.052-2.176);携带rs7816475 GG基因型、AA+AG基因型的乙肝病毒感染史阳性者肝癌发病风险显著增加,OR 值分别为 22.288(95%CI=14.155-35.095);29.163(95%CI=15.503-54.858);CCAT2基因中的rs10808556遗传变异与肝癌家族史存在相乘交互作用(P=0.047),携带rs10808556TT基因型、CC+TC基因型的肝癌家族史阳性者肝癌发病风险增加,OR值分别为2.981(95%CI=1.792-4.960)、8.616(95%CI=3.013-24.635);PVT1基因中的rs13281615遗传变异与饮酒史、乙肝病毒感染史同时存在相乘和相加交互作用(P<0.05),携带rs13281615 GG基因型、AA+AG基因型的饮酒史阳性者肝癌发病风险增加,OR值为2.625(95%CI=1.884-3.658)、1.548(95%CI=1.154-2.078),携带 rs13281615 GG 基因型、AA+AG基因型的乙肝病毒感染史阳性者肝癌发病风险显著增加,OR值分别为26.637(95%CI=16.906-41.969)、17.032(95%CI=11.512-25.199);PRNCR1基因中的rs13252298遗传变异与饮酒史存在相乘交互作用(P=0.048),携带rs13252298 GG+AG基因型的饮酒史阳性者肝癌发病风险增加,OR值为1.416(95%CI=1.047-1.916)。7、对 CCAT1上的 rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的rs10808556,PVT1上的 rs13281615、rs13257657,CASC8上的 rs1562430,PRNCR1上的rs13252298共8个基因进行分析,MDR结果得:最佳的2因子模式是CCAT1基因中的rs6989575和CASC8基因中的rs1562430多态,预测准确率最高,TA(Testing accutracy)预测准确率=59.25%,CVC达到10/10,但经1000次置换检验该模型无统计学意义(P>0.05)。8、对CCAT1上的rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的rs6983267,PVI1上的 rs13281615、rs13257657、CASC8 上的 rs1562430,PRNCR1上的rs1016343共8个基因与饮酒史、曾饮用沟塘水、乙肝病毒感染、肝吸虫感染史、肝癌家族史、肿瘤家族史共5环境因素进行分析,MDR结果得:三因子的最佳模型为PVT1基因的rs13281615多态与乙肝病毒感染、饮酒史,且该三因子模型的预测准确性最高,TA=78.92%。CVC达到8/10,经1000次置换检验该模型具有统计学意义(P<0.001)。结论1、广州顺德地区的肝癌发病以中老年男性高发,肝癌相关危险因素为:乙型肝炎病毒感染、肝吸虫感染、吸烟、饮酒、有无进食鱼生史、是否饮用沟塘水、肝癌家族史、肿瘤家族史。2、PVT1基因中的rs13257657位点、rs13281615位点、CCAT1基因中的rs6989575位点可能与肝癌发生风险有关联,但需进一步验证。3、本研究中未发现多基因间存在有意义的基因-基因交互模型。4、PVT1基因的rs13281615多态与乙肝病毒感染、饮酒史可能存在基因—环境交互作用,但仍需在今后的研究中进一步扩大规模,选择在其他地区及种族人群进行研究。