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原始卵泡的形成及之后发育成初级卵泡在卵巢发育生物学上是很重要的过程,该过程直接影响了女性一生中能够提供的卵子数。一旦原始卵泡库耗竭,就会出现绝经,而这一过程调节失常可能会出现卵巢早衰(POF)或不孕等相关的卵巢疾病。然而,到目前为止,原始卵泡形成和发育的分子机制还不是很清楚。为了更好的理解原始卵泡形成和发育的过程,我们运用双向凝胶电泳(2-D PAGE)和质谱(MALDI-TOF/TOF)技术构建了大鼠卵巢在代表原始卵泡形成及发育的4个特定时间点(出生后0小时,24小时,48小时和72小时)的差异蛋白表达谱。我们共分离鉴定出154个差异蛋白点,对应于134种蛋白质。进一步的聚类分析将这些差异蛋白点划归为4类表达模式(C0-C3),这些不同的表达模式与卵巢早期发育过程中发生的特定生物学事件相关。为了验证这些差异蛋白的表达模式,我们随机选择了6种蛋白用Western blot的方法进行验证,并进一步用免疫组化的方法确定其细胞定位。此外,运用生物信息学的方法对这些差异蛋白进行了详细的功能分析。对这些差异蛋白的鉴定及其功能分析有助于我们进一步理解原始卵泡形成和发育的分子机制,并为临床调节卵巢功能以及处理卵巢疾病提供了大量潜在的分子靶标。为了进一步研究卵泡早期发育的分子机制,我们从构建的差异蛋白表达谱中挑选了一个转录因子Hnrnpk展开深入的功能研究。Hnrnpk在出生后24小时(原始卵泡装配的起始点)表达上调,主要定位于卵母细胞及颗粒细胞的细胞核中。我们运用siRNA干涉的方法来研究Hnrnpk在卵泡早期发育过程中的功能。结合新生大鼠卵巢体外培养的技术平台,在卵巢早期发育过程中通过Hnrnpk siRNAs降低Hnrnpk基因的表达。结果发现,卵巢中卵细胞的数目,原始卵泡和初级卵泡的数目均明显减少;卵巢的组织结构发生严重的紊乱伴随着大量卵母细胞聚集成巢状,成簇的体细胞与卵母细胞不形成卵泡结构,而且许多卵细胞呈核固缩状,Tunel结果证实较多细胞发生了凋亡。我们应用基因芯片技术比较分析了Hnrnpk siRNAs干涉组与对照组卵巢中基因的差异表达,筛选出63个共同存在的2倍以上差异表达的基因,其中22个基因表达上调,41个基因表达下调。生物信息学分析提示这些差异基因涉及卵巢早期发育过程中多种关键性的生物事件。以上结果表明,转录因子Hnrnpk可以通过调控下游靶向基因的表达进而影响原始卵泡的形成和发育,是卵巢早期正常发育过程中一个重要的调控因子。