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本研究采用Fab噬菌体载体pComb 3H系统,选择了5位体内含高滴度的抗狂犬病毒抗体的志愿者,采集他们的抗凝外周血并分离淋巴细胞,提取细胞内的总RNA,并逆转录为互补的cDNA,利用人Fab抗体引物扩增抗体轻链和重链Fd段因片段,分别通过轻链酶切位点Sac I/Xba I和重链链酶切位点Xho I/Spe I克隆入pComb 3H噬菌体抗体库载体,构建成人源抗狂犬病毒的噬菌体Fab抗体库。将Fab抗体库菌库包装成噬菌体库,使用纯化的狂犬病毒颗粒aG株和CTN株对噬菌体库进行富集筛选,在最后一轮筛选富集后,挑取每个库至少挑取200个克隆进行原核诱导表达,包被抗人Fab抗体检测Fab抗体表达上清进行抗体表达检测,包被病毒颗粒检测抗体结合的特异性,双阳性克隆序列测定获得序列,登录VBASE2网站,输入抗体序列,通过与数据库中序列比较,确定抗体的轻链亚类和重链类型,以及可变区的CDR区基因。我们获得2株重链相同轻链相似的Fab抗体,选择其中一株表达为IgG全抗体,通过ELISA.免疫印迹和间接免疫荧光实验证实抗体特异性结合磷蛋白。虽然中和试验表明磷蛋白抗体并没有中和病毒的作用,但磷蛋白可以结合核蛋白、聚合酶蛋白,在调节病毒转录和复制过程发挥作用。分析磷蛋白序列,利用截短突变的方法确定表位,以狂犬病病毒磷蛋白全长为模板,N端截短,C段不变,构建P1,P2,P3,P4,P5截短克隆；C端截短,N段不变,每隔20个氨基酸进行截短,构建△C20,△C40,△C60,△C80,△C100截短克隆,截短片段C端带有HIS标签,瞬时转染表达,WB分析表位。结果显示,磷蛋白截短克隆P1、P2、P3、P4、P5和P△C20、P△C40、P△C60、P△C80、P △C100与抗HIS抗体反应,说明磷蛋白截短蛋白均有表达；而只有P1,P2,P3, P4,P5和P△C20与RV1A2反应,P△C40,P△C60,P△C80,P△C100却没有反应,提示目的表位位于257～277位氨基酸之间。随后构建更短截短片段的截短突变,将表位定于262～266位氨基酸(VLGWV)之间。查询磷蛋白晶体结构(186～297)(PDB：1VYI),分析磷蛋白3D结构和抗原抗体对接,推测RV1A2结合W265氨基酸。分析狂犬病毒属7种基因型的129条序列,发现该位点(VLGWV)高度保守。将RV1A2抗体改造为单链抗体(scFv),克隆入真核细胞表达载体pEF/myc/cyto中,在细胞质内定位表达,保证80%以上的细胞均有阳性表达。用狂犬病病毒攻击毒株CVS-11进行染毒,染毒后一到四天每天鉴定细胞内病毒复制情况和上清中病毒分泌情况。研究显示,细胞内抗体具有明显的病毒复制抑制功能,抗磷蛋白细胞内抗体在病毒易感细胞MNA细胞的表达会降低上清中的病毒滴度。由于抗体表位位于C端,与P1, P2, P3, P4, P5均能结合,具有较好的的结合广谱,而且该位点高度保守,因此狂犬病病毒磷蛋白C端会是一个较好的作用靶点。然而细胞内抗体抑制病毒增殖只是初步试验,还需要更进一步证据。细胞内抗体作为一种药物靶点,如何穿过血脑屏障和精确的细胞内定位,还有很长的路要走。