研究背景:牙髓炎主要是由细菌及其毒力因子感染引起的牙髓的炎症性疾病,常以自发性疼痛为主要临床症状。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）是一种引起牙髓急性炎症的革兰氏阴性厌氧菌,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）作为其细胞壁的主要成分会持续存在于牙本质小管中并抵抗其被清除,通过刺激Toll样受体4来激活牙髓的炎症反应。地塞米松是一种具有高效抗炎活性的合成糖皮质激素,广泛应用于炎症和自身免疫性疾病。然而,在目前牙髓炎的预防和治疗领域,大多数涉及地塞米松的研究仅检测其对牙本质桥形成和牙髓疼痛缓解的作用,并非其抗炎作用。此外,尽管有报道称地塞米松在体外可以诱导人牙髓干细胞（Dental pulp stem cells,DPSCs）的牙源性分化,但尚未阐明其在P.gingivalis-LPS诱导的DPSCs炎症中发挥的抗炎作用及其作用机制。蛋白质组学作为一门在整体水平上探究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质间相互作用的学科,在探索疾病生物标志物和药物治疗靶点等方面的研究中发挥着重要作用。在牙髓病学领域,蛋白质组学已被用于探究牙髓组织的结构形成、牙髓疾病的诊断、牙髓再生及间充质干细胞的功能,促进了牙髓组织工程的快速发展。因此,利用蛋白质组学探索地塞米松在P.gingivalis-LPS诱导的DPSCs炎症中的抗炎作用及其分子机制具有重要的意义。研究目的:本研究拟探索地塞米松在P.gingivalis-LPS刺激的DPSCs产生的炎症微环境中的作用,并利用蛋白质组学技术研究地塞米松治疗牙髓炎的分子机制及其潜在的作用靶点。研究方法:1、收集临床需拔除的健康无龋的第三阻生磨牙并分离培养人DPSCs,利用流式细胞术鉴定DPSCs干细胞表面抗原标记物,利用成骨成脂诱导实验和单克隆集落实验检测DPSCs多潜能分化特性。2、CCK8法检测地塞米松(0,10-9,10-8,10-7,10-6,和10-5 mol/L)对DPSCs增殖的影响。3、P.gingivalis-LPS和地塞米松刺激DPSCs后,采用q PCR检测IL-6,IL-8,TNF-α和COX-2等炎症因子的m RNA表达水平;利用ELISA检测DPSCs上清液中炎症因子IL-6和IL-8的分泌水平。4、利用非标记蛋白质组学技术定量分析DPSCs中差异表达的蛋白质信息:DPSCs分为空白对照组（C组）、炎症组（L组）和地塞米松治疗组（LD组）。5、利用生物信息学技术对差异表达蛋白进行GO功能注释分析、KEGG通路富集分析、PPI蛋白互作分析。6、利用比较毒理学数据库（CTD,ctdbase.org）挖掘地塞米松减轻牙髓炎炎症反应的潜在的药物靶点信息,并利用Western blot验证蛋白组学结果。研究结果:1、原代培养的DPSCs流式细胞术检测CD90和CD105的阳性率分别为99.54%和99.75%,CD34和CD45的阳性率分别为1.04%和0.08%。茜素红染色后观察到矿化结节,油红O染色可见颗粒状脂滴,甲苯胺蓝染色可见细胞集落形成。2、低浓度的地塞米松(10-9,10-8,10-7和10-6 mol/L)浓度依赖性促进DPSCs的增殖,而高浓度10-5 mol/L的地塞米松则能抑制DPSCs的增殖。3、q PCR结果显示地塞米松抑制了P.gingivalis-LPS诱导的DPSCs中IL-6,IL-8,TNF-α和COX-2 m RNA的表达,ELISA结果表明地塞米松可以显著降低IL-6和IL-8的蛋白分泌水平。4、蛋白组学结果按照p＜0.05和|log2 FC|≥1的标准,最终筛选得到的差异表达蛋白:C-vs-L共242个（上调133个,下调109个）,C-vs-LD共196个（上调64个,下调132个）,L-vs-LD共68个（上调13个,下调55个）。5、GO注释与KEGG通路富集显示,差异蛋白主要参与了中性粒细胞介导的免疫途径、泛素蛋白连接酶结合途径、RNA剪接途径、IL-17信号途径、碳代谢途径等。PPI网络分析结果显示排名前5的蛋白质为SRSF1、U2AF2、CCT4、H3-2和RPL8。6、CTD分析结果表明PLIN2、ACAT1、C1QBP、CIRBP、PSMC4、RPL23A、ASPH、G6PD和CCT4可能是地塞米松治疗牙髓炎的潜在作用靶点。Western blot结果证实蛋白组学结果可靠。研究结论: 地塞米松可以减轻P.gingivalis-LPS诱导的DPSCs炎症反应,可能通过参与中性粒细胞介导的免疫途径、泛素蛋白连接酶结合途径、RNA剪接途径、IL-17信号途径、碳代谢途径等信号通路参与抗炎过程,PLIN2、ACAT1、C1QBP、CIRBP、PSMC4、RPL23A、ASPH、G6PD和CCT4可能是地塞米松减轻牙髓炎炎症反应的潜在作用靶点。