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血小板的主要生理功能是参与血栓与止血，任何凝血过程都涉及血小板的活化，这是一个复杂的信号级连过程，凝血酶在其中占有核心地位。凝血酶活化血小板主要通过一族G蛋白偶连的蛋白酶活化受体PARs（protease-activated receptors）介导。人类血小板表面表达PAR1与PAR4两种受体，凝血酶能连接并切割PAR1或PAR4，暴露新的N-末端，后者作为一个固定配基与受体进行分子内结合，从而激发跨膜信号传导，引起血小板聚集、释放以及膜糖蛋白的一系列改变。GPIb是血小板表面的重要粘附分子，也能与凝血酶结合，对维持血小板结构功能具有重要意义。凝血酶活化血小板后，GPIb由膜表面进入开放管道系统（OCS）并失去与表面抗体的亲和性，但随着活化时间延长又重新返回血小板表面，出现可逆性的动态变化过程。 为比较两类PAR受体在血小板信号传递中的作用，确定它们是否也能引起GPIb的动态分布，并了解这一过程中细胞骨架所发挥的作用，我们选择25μM PAR1-AP（SFLLRNPNDKYEPF）与250μM PAR4-AP（AYPGKF）分别模拟各自的固定配基活化血小板。结合血小板聚集试验、流式细胞仪、荧光显微镜、蛋白电泳以及免疫共沉淀技术，测定相应的血小板聚集率以及血小板膜表面糖蛋白GPIbα与P-选择素表达，分析细胞骨架中GPIbα、肌动蛋白与肌球蛋白的变化。在这同时，应用Cytochalasin D（肌动蛋白多聚化抑制剂）、BAPTA／AM(螯合胞内Ca2+)、wortmannin（抑制磷脂酰肌醇-3-激酶PI3-K及肌球蛋白轻链激酶MLCK）、ApyraseⅦ（低ATP／ADP酶，促使ADP分解）、Ro-31-2220（蛋白激酶C选择性抑制剂）及Y27632（抑制Rho激酶）等多种血小板抑制剂，观测它们对血小板活化过程的影响，以揭示PAR活化的部分机制。 血小板聚集试验显示，PAR1与PAR4途径都能活化血小板但作用强弱不等，PAR1（SFLLRNPNDKY）＞PAR4（AYPGKF）＞PAR4（GYPGKF）＞PAR4（GYPGQV）。另洲人学博士学位论又中文摘要 PARI一AP（sFLLRNPNDKYEPF）与pAR4一Ap（AYpGKF）都可以引起血小板膜表面糖蛋白GPIba呈现可逆性的动态分布，达到最大程度50%的膜内逆转，之后都缓慢地返回血小板表面。活化后各时间段两者之间均存在明显差异（P都<0.05）。PARI首先在2分钟达到最低值，而PAR4在5分钟表达最低，随后较PARI缓慢地回升。GPIba的这一内转过程同时伴随血小板形态的收缩。选择足以刺激血小板形态改变的不同活化剂浓度都可以引起Gl，Jb。类似的动态改变。抑制剂CytochalasinD与BAPTA/AM （20林M）则能阻滞GPlba的内转及细胞形态的改变，又以CytochalasinD的抑制效果更完全。然而，活化过程中血小板膜表面P一选择素水平未出现可逆性的改变，!分钟明显增多，2分钟后就一直维持于最高水平。 护AR肤刺激过程中GPIba进入肌动蛋白骨架，肌动蛋白、肌球蛋自在细胞骨架中也明显增多。其中PARI一AP刺激后1分钟达到高峰，PAR4一AP在5分钟达到最高值，以后随着时间延长呈现可逆性的分布规律。CytochalasinD与BAPrrA/AM应用后抑制了GPIb。向骨架中心的移位，肌动蛋白的改变也受到明显阴.滞，而肌球蛋白受BAPTA/AM影响的程度比Cytoehalasilll)张。 共免疫沉淀结果显小，“J GPIba相连的肌球蛋白、肌动蛋自随PAR肤i舌化也竹时增多。PAR卜八P在l分钟已经达到高峰，PAR4则石一1一5分钟出现最大值，之后都逐渐减少，呈现先结合后解离的可逆性变化曲线。其中肌球蛋自比肌动蛋自的改变更明显。cytocllalasinD与BAFI’A/AM作用后同样可以减弱肌球蛋自及肌动蛋自与GPlba的结合。 100，IM一与10、:Mw。:tmallllill处理一血二小板，分别抑制磷脂酞肌醇一3一激酶 （pl3一K）及jJ)七球蛋白轻链激酶（MLCK）活性。发现10林M wortmal飞nil飞能抑制血小板聚集，100nMwortmallnin使血小板容易发生解聚。流式细胞仪及荧光显微镜显示GPlba的动态分布过程中，1 oonMwortmannin能部份抑制GPIb以向胞内移动，}丫口1饵、M wortmallnin对整个PAR活化过程中的GPlba逆转没有任何影响，只对PARI刺激过程中GPlba的恢复起作用，延缓它重新返回111}小板表面的进程。蛋白电泳中1。卜Mwol，t mannin既不能苏州人学博士学位论文中文摘要阻lLGPIba及肌动蛋白向骨架中J合集中，也不能抑制活化初期肌球蛋白及肌动蛋白与GPIb。的连接，却延缓GPIb。及肌动蛋白在胞质中心的消散，减慢肌球蛋白及肌动蛋白与GPIba的解离速度。 ApyraseVH在一定程度上影响血.小板聚集，增加诱导血‘小板聚集所需要的PAR月太浓度。ApyraseVH不能影响活化初期GPlba向细胞内的逆转，但促使GPIba尽快回复细胞表面，这在PARI的活化过程中更明显（10、3（）分钊，，P值<0.05）。 血小板聚集反应受Ro一3卜222。作用而抑制，但变形波不受影响。10抖MRO一31一2220可以明显抑制PARI一AP引起的GPIb。内陷（1、2分钟，P值均<0.05），对J几PAR4一AP则延长GPIba在胞内的逗留，减缓它返回膜外的进程仁10、3〔)分钊”，P值均<0.05)。 20扒MBAJ，TA/AM能完全抑制PARI一AP与PAR4一AP诱导的血一小板聚集，但变形波没有改变。Y27632不影