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因创伤、肿瘤等各种原因造成骨缺损的治疗一直是骨科界的难题。以往治疗方法包括自体骨移植、同种异体骨移植及生物材料替代等，其均不同程度地存在着来源有限、组织成骨能力差及具有免疫排斥反应等缺陷，并且在对较大骨缺损进行骨移植时，新骨形成之前移植骨容易被机体吸收，造成植骨失败，所以骨组织工程的提出和发展无疑为这一医学难题的解决提供了崭新前景。随着目前骨组织工程研究的快速发展，组织工程化骨已成为最具希望广泛应用于临床的组织工程成果之一，它不仅免除了自身骨移植的供区损伤，同时也避免了同种异体移植供体来源有限及其不可避免的免疫排斥反应。尤其是近年来，三维立体生物可降解性材料及细胞培养等技术的不断发展，为骨组织工程的广泛应用创造了有利条件。 近年来骨组织工程研究在种子细胞、支架材料及组织工程化骨体外构建等方面均取得了较大进展。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)因其具有的诸多优点并能多向分化而日渐成为具有良好应用前景的种子细胞来源。对来源于骨膜等不同部位的成骨细胞体外生物学特性的研究表明，不同部位骨及骨膜组织来源的成骨细胞体外培养多代后仍能维持其表型，但将间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨表型诱导后细胞生物学特性以及诱导后的细胞体外构建组织工程活性骨及体内植入过程中的表型维持情况，却未见相关报道。本实验观察了MSCs向成骨诱导后的成骨特性表达及维持情况，以及成骨诱导的MSCs在细胞-支架复合体体外构建及体内植入过程中的成骨表型维持特性。同时，本研究也观察了在细胞-支架复合体构建中，一定范围内的种植浓度与粘附细胞数及粘附率的关系，以及细胞-胶原凝胶上架法对粘附率的影响。本研究进行了以下三部分实验： 1、构建兔骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells, BMSCs)与活骨组织共培养模型，以模拟体内“成骨微环境”，将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养，观察经成骨诱导的MSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况；并将兔骨髓间充质干细胞置于药物成骨诱导培养、与活骨组织共培养及普通传代培养下观察BMSCs的成骨分化特性。结果显示：(1)药物成骨诱导培养及共培养的间充质细胞，其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P＜0.05)，其中各个指标成骨诱导培养均最高；经过诱导培养的间充质细胞，其Ⅰ型第三军医大学硕士学位论文胶原、骨钙素免疫组化强阳性，共培养的间充质细胞I型胶原阳性，骨钙素弱阳性;对照组I型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。RT一PCR法半定量测定I型胶原mRNA亦提示，成骨诱导培养及共培养的间充质细胞的I型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组，同时成骨诱导培养亦高于共培养。结果表明:药物成骨诱导培养呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点，能使细胞碱性磷酸酶、骨钙素及I型胶原表达短期内达到高水平;共培养条件亦可促进MSCs向成骨细胞分化，但其作用明显弱于药物成骨诱导。(2)药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后(总培养时间为40天)，ALP活性、骨钙素水平及I型胶原表达稳定维持在较高水平，保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下，ALP活性、骨钙素水平及I型胶原表达保持在高水平，并且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养.这表明:经成骨诱导的MSCs无论在体外或模拟的体内传代培养条件下，均能维持成骨表型，保持成骨活力。 2、采用熔铸颗粒沥取法制备CPP钾LLA支架材料，模拟组织工程化活性骨构建过程，在体外将成骨诱导的MSCs与CPP钾LLA支架复合后，分别检测了体外与支架复合后3天及其继续进行共培养1周的细胞成骨特性，观察了与CPPf/PLLA支架复合后细胞成骨活性的表达。结果显示:(l)支架材料成具有高孔隙率的纤维网状结构。(2)成骨诱导细胞与 CPP刀PLLA支架复合后体外培养三天及与继续活骨组织共培养1周，细胞的ALP活性、细胞内骨钙素含量及I型胶原mRNA表达量与同期体外传代培养的成骨诱导细胞(对照组)均无显著性差异(P>0.05)。结果表明:CPP钾LLA支架材料具有较好的生物相容性，与成骨诱导的MSCs复合后对细胞成骨活性无明显影响。 3、对以成骨诱导的MSCs为种子细胞、以CPP仰LLA为支架的细胞一支架复合物体外构建进行了初步研究。不同浓度的成骨诱导MSCs接种于CPP钾LLA支架，用MTT法比较不同浓度下细胞的粘附率;同时，观察血清预涂的CPP钾LLA支架与单纯CPP钾LLA支架、细胞一胶原凝胶上架方法与直接上架方法的细胞上架率比较。结果显示:(l)兔MSCs成骨细胞的M竹光吸收值(A4劝与直接计数之间具有较好的线性相关性，可以检测活细胞数;(2)细胞浓度在1 x 106一6x 206/而间时，在cPP仰LLA支架上的粘附细胞数随着浓度提高而增加，同时粘附率有不同程度的降低;而细胞浓度为8xl。今而和10xl0勺nil时，粘附细胞己无显著差异。(3)血清预涂的cPP仰LLA支架与单纯cPP仰LLA支架的细胞粘附率在4 x 10e/ml、8 x 10石/ml浓度均无显著性差异(P>0.05);而细胞一胶原凝胶上架方法与直接上架方法比较存在显著性?