目的:干扰素(IFNs)是固有免疫和抗病毒免疫研究中备受关注的细胞因子之一,其介导的抗病毒免疫信号在宿主抵抗病毒感染方面发挥着极其重要的作用。近几年,对IFNs信号的研究主要集中在该信号中关键蛋白质的磷酸化调控方面。随着人们对蛋白质泛素化研究的深入,蛋白质的泛素化和去泛素化修饰逐渐受到重视。我们的前期研究发现,去泛素化酶USP2a显著增强了 IFNs信号通路。与此同时,我们发现另一个去泛素化酶USP12也参与了IFNs信号的调控。有趣的是,我们发现USP12的这一作用并不依赖其去泛素化酶的活性。进一步研究提示,USP12可能通过影响CBP发挥作用。因此,本研究主要探讨USP12如何影响IFNs信号通路中的关键蛋白CBP,进而调控IFNs信号通路及其抗病毒功能。本研究旨在为增强IFNs抗病毒疗效提供理论依据。方法:(1)利用Flag-HA-USP12(FH-USP12)表达质粒转染细胞,免疫共沉淀Flag,结合质谱分析的方法,筛选鉴定出与FH-USP12相互作用的蛋白CBP;探究USP12与CBP蛋白相互作用区段;研究USP12对CBP蛋白水平的调控;分析USP12对CBP乙酰转移酶活性的影响。(2)利用USP12敲低质粒转染细胞,采用Western Blot实验方法,分析敲低USP12是否影响CBP对IFNs信号通路中IFNAR2和STAT2乙酰化的调控;进一步探究USP12对ISGF3三聚体复合物形成的影响。(3)采用Western Blot及Confocal实验技术,分析USP12在IFNs诱导情况下细胞内定位情况。(4)利用FH-USP12表达质粒或者USP12 knockdown质粒转染HEK293T细胞,核质分离后,采用Western Blot实验技术,分析USP12对核内STAT1及p-STAT1乙酰化的影响;体外实验分析USP12对STAT1乙酰化的影响;分析USP12对核内p-STAT1蛋白水平的影响。(5)在细胞中过表达USP12或者knock-down USP12后,利用Western Blot实验技术检测IFNs诱导的总p-STAT1的变化;利用双荧光素酶报告基因技术检测ISRE的转录活性;利用RT-qPCR技术,研究ISG-mRNA水平的变化;采用免疫荧光观察VSV-GFP的荧光强度,分析USP12在IFNs介导的抗病毒功能中的作用。(6)采用Western Blot实验技术、双荧光素酶报告基因技术、RT-qPCR技术分析USP12是否通过其去泛素化酶调控IFNs信号。(7)利用CRISPR/Cas9实验技术构建USP12-KO稳定细胞系,通过Western Blot实验技术、双荧光素酶报告基因技术、RT-qPCR技术分析USP12对IFNs信号通路的影响。结果:(1)质谱结果显示USP12能与乙酰转移酶CBP相互作用;USP12不影响CBP的蛋白水平,但可以通过与CBP的HAT区结合后,影响CBP介导的细胞内蛋白乙酰化水平。(2)USP12抑制CBP对IFNs信号通路中IFNAR2和STAT2乙酰化的调控水平;进一步研究发现USP12通过影响CBP活性的发挥,降低ISGF3三聚体复合物的形成。(3)在IFNs诱导的情况下,USP12会由细胞质向细胞核易位。(4)USP12在细胞核内降低p-STAT1的乙酰化;在敲低USP12之后,p-STAT1的乙酰化明显增加。进一步研究发现,USP12可降低p-STAT1的乙酰化,进而抑制p-STAT1与TCPTP的相互作用,上调核内p-STAT1的蛋白水平。(5)USP12明显增加总p-STAT1的蛋白水平;利用双荧光素酶报告基因技术,发现USP12明显增加IFNs诱导的ISRE的转录活性;利用RT-qPCR技术,发现USP12明显增强IFNs诱导的ISGs-mRNA水平;采用免疫荧光观察VSV-GFP的荧光强度,实验结果显示USP12增强IFNs介导的抗病毒功能。(6)USP12不依赖去泛素化酶活性调控IFNs信号通路及其抗病毒功能。(7)利用CRISPR/Cas9实验技术构建USP12-KO稳定细胞系,敲除USP12后抑制IFNs信号通路并降低IFNs介导的抗病毒免疫反应。研究结论:USP12通过与CBP的HAT区相互作用,抑制CBP介导的乙酰化作用,进而抑制核内p-STAT1与磷酸酶TCPTP的相互作用,稳定核内p-STAT1的蛋白水平,正向调控IFNs信号通路,最终增强了宿主的抗病毒功能。