论文部分内容阅读
研究背景：血管内皮损伤是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）等众多心血管疾病的起始过程和共同通路，多种危险因素通过对内皮的损伤而启动或加重了AS等的病理过程并贯穿始终。因此，在血管内皮损伤时做到早期诊断并及时干预，对于预防或延缓心血管疾病的发生发展具有重要作用。MicroRNA（miRNA）是一类约由19~25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，通过抑制转录后基因表达或促进靶基因mRNA降解发挥重要的调控作用。近期发现，循环血中某些miRNA的水平可作为心血管系统多种疾病诊断和预后的标志物。研究目的：确定内皮细胞损伤后循环血中miRNA的水平，寻找可作为内皮损伤诊断标志物的循环血miRNA。研究方法：利用miRNA芯片检测血管内皮细胞miRNA的表达谱，根据正常人血浆miRNA的含量，确定候选miRNA。分别取20只12周龄、体重相近的雄性SD大鼠，通过高脂饮食联合腹腔内注射维生素D3注射液构建大鼠高血脂模型；通过腹腔内注射链脲佐菌素（Streptozocin, STZ）溶液构建大鼠高血糖模型，同时取5只大鼠予以标准饮食同时腹腔内注射等体积的生理盐水（高血脂模型）或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（高血糖模型）分别作为模型的对照组，定期测量体重。在建模的不同时间定期股静脉采集血标本（高血脂模型10天取血一次；高血糖模型5天取血一次）。利用Elisa反应测定血浆中总胆固醇（Total Cholesterol, TC）、甘油三酯（Triglycerides, TG）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein, LDL）、高密度脂蛋白（High-density Lipoprotein,HDL）的含量验证高血脂大鼠模型的建立；剪尾测血糖验证大鼠高血糖模型的建立。建模不成功的大鼠不被纳入本实验。利用苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测血管内皮细胞形态变化；油红O染色检测血管内皮下脂质沉积；Elisa方法检测血浆可溶性细胞间粘附分子(Souble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)的含量变化鉴定血管内皮损伤的程度。定量PCR的方法检测血浆中候选miRNA的含量变化。实验结果：(1)通过miRNA芯片检测人血管内皮细胞miRNA的表达谱，发现27种miRNA在血管内皮细胞中高表达，结合正常人血浆中这些miRNA的含量，我们选择其中的11种miRNA(miR-21、miR-126、let-7a、miR-222、miR-23a、miR-221、miR-125b、miR-26a、miR-29a、miR-16和miR-100)作为本实验所要检测的目标miRNA。(2)高血脂大鼠建模存活率为70%，在腹腔内注射维生素D3联合高脂饲料喂养后10天时，血脂水平较建模前及对照组明显升高（TC：4.00±0.64mmol/L vs1.81±0.53mmol/L；LDL：2.72±0.13mmol/L vs0.63±0.32mmol/L），HE染色结果显示内皮细胞形态无明显变化，油红O染色显示内皮下无脂质沉积；20天时血脂水平保持较高水平（TC：2.65±0.21mmol/L, LDL：1.17±0.38mmol/L），HE染色显示内皮细胞形态无明显变化，油红O染色显示内皮下无脂质沉积；喂养30天时，血脂水平持续较高水平（TC：2.80±0.32mmol/L；LDL：1.71±0.45mmol/L），主动脉HE染色可见内膜增厚，油红O染色显示内皮下有微量脂质沉积。此时，Elisa检测结果发现sICAM-1水平明显高于对照组（2628.78±188.35pg/mL vs1352.43±101.52pg/mL），定量PCR结果显示血浆中miR-126、let-7a、miR-21和miR-26a的水平明显升高，miR-29a的水平明显降低，miR-125b、miR-23a、miR-221、miR-222、miR-100和miR-16的水平无明显变化，其中miR-26a的变化最为显著，较建模前升高了5倍多。(3)高血糖大鼠模型的建模成功率为80%，腹腔内注射STZ溶液后5天血糖较建模前及对照组明显升高（24.61±6.96mmol/L vs7.91±0.37mmol/L），10天后血糖保持较高水平（25.68±4.78mmol/L），HE染色结果显示内皮细胞形态无明显变化；15天后血糖稳定在较高水平（26.28±6.34mmol/L），HE染色结果显示血管内皮细胞无明显变化；20天后血糖仍在较高水平（29.01±4.24mmol/L），HE染色结果显示血管内膜增厚、结构紊乱。此时，Elisa检测结果发现sICAM-1水平明显高于对照组（4643±1013pg/mLvs2120.56±645.77pg/mL），定量PCR结果显示，建模后20天血浆中miR-126、miR-21和miR-221的水平出现了明显的升高，miR-16和miR-23a的水平明显降低，miR-125b、miR-29a、miR-222、miR-100、let-7a和miR-26a的水平无明显变化。结论：（1）高血脂及高血糖引起血管内皮损伤时，血浆中内皮细胞高表达的miR-126、miR-21均明显升高。（2）血浆miR-126、miR-21具有作为血管内皮损伤标志物的的潜能。