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目的（1）通过小鼠成熟卵母细胞慢速冷冻实验,探讨冷冻液中不同的蔗糖浓度对小鼠成熟卵母细胞冷冻效果的影响;探讨不同体外培养时间对小鼠复苏后的卵母细胞受精和胚胎发育情况的影响;初步试验辅助激活方法补救复苏后单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）受精失败的卵母细胞的可行性。（2）通过人成熟卵母细胞的慢速冷冻实验,比较冷冻液中不同的蔗糖浓度对人类卵母细胞慢速冷冻效果的价值;（3）采用免疫荧光染色方法,通过激光共聚焦显微镜观察人类成熟卵母细胞冷冻前后、复苏后不同时间内纺锤体和染色体形态学变化;探讨冷冻和体外培养时间对人类卵母细胞第二次减数分裂时期纺锤体和染色体的影响,为人类成熟卵母细胞冻融方法的改进和后期发育结局的改善提供实验依据。方法（1） 30只清洁级成年健康昆明小白鼠,进行控制性超促排卵（COH）后获取小鼠成熟卵母细胞,比较冷冻液中不同蔗糖浓度（0.2mol/l蔗糖vs0.3mol/l蔗糖）的冷冻效果;（2）复苏后存活良好的卵母细胞培养不同的时间（1h、2h、3h、4h、5h）行ICSI,观察受精和胚胎发育情况;比较新鲜和解冻后ICSI受精失败的卵母细胞采用Ca2+载体离子霉素联合嘌呤霉素辅助激活的效果。（3）人成熟卵母细胞124枚随机分为两组行慢速程序化冷冻,冷冻液中分别采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖,了解两组冻融后的存活情况;（4）两组存活良好、外观形态正常的64枚卵母细胞,随机分为3组,分别体外培养不同的时间（1h、3h、5h）后固定荧光染色,同时用18枚新鲜的人成熟卵母细胞荧光染色作为对照组,在激光共聚焦显微镜下观察纺锤体和染色体的形态。结果（1） 0.2mol/l蔗糖组和0.3mol/l蔗糖组相比,小鼠成熟卵母细胞冻融后存活率分别为60.5%、80.7%,两组相比有显著差异性（P<0.05）;复苏后小鼠卵母细胞体外培养不同的时间（1h、2h、3h、4h、5h）,结果显示培养3h、4h组的卵母细胞正常受精率、囊胚形成率和培养1h、2h组结果相比有明显差异（p <0.05） ;3h、4h两组之间正常受精率和囊胚形成率相比无统计学差异（p>0.05）;培养1h、2h两组结果相比,无统计学差异（p>0.05）;培养5h组中部分卵母细胞ICSI前已经发生卵裂,其剩余卵母细胞正常受精率和囊胚形成率和其它组相比无统计学差异（p>0.05） ;几组正常受精后的胚胎卵裂率无统计学差异（p>0.05）。采用Ca2+载体离子霉素联合嘌呤霉素辅助激活解冻后ICSI受精失败的卵母细胞,冻融组卵母细胞激活率明显低于新鲜组（30.4%vs71.1%,p <0.05）,冻融组有一枚激活的卵母细胞发育至囊胚。（2）人成熟卵母细胞采用慢速程序冷冻方法,冷冻液中采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖,存活率分别为56.5%、80.6%,两组相比有明显差异性（P<0.01）。复苏后存活良好的人卵母细胞体外培养不同的时间（a组:1h、b组:3h、c组:5h）固定荧光染色,三组冻融后的卵母细胞纺锤体正常比例明显低于对照组新鲜卵母细胞（10.0% vs 83.3%,P<0.05; 45.5% vs 83.3%, P<0.05; 40.9% vs 83.3%, P<0.05）;a组纺锤体的缺失率明显高于对照组（45.0% vs 5.6%, p <0.5）。在冻融后的卵母细胞中,a组分别和b组、c组相比,纺锤体正常比例明显下降（10.0% vs 45.5%, p <0.05; 10.0% vs 40.9%, P<0.05）;纺锤体缺失率明显增高（45.5% vs 13.6%, p <0.05; 45.5% vs 13.6%, P<0.05）。b、c两组纺锤体观察结果相比无明显差异。a组与b组、c组和对照组三组相比,正常染色体率明显降低（30.0% vs 68.2%,p <0.05; 30.0% vs 63.6%, P<0.05; 30.0% vs 77.8%, P<0.05）。b组、c组、对照组三组染色体观察结果相比,无明显差异（p>0.05）。结论（1）慢速冷冻小鼠成熟卵母细胞,CPA中0.3mol/l蔗糖较0.2mol/l蔗糖可以明显提高冻融后卵母细胞存活率;复苏后的小鼠卵母细胞ICSI前培养3～4h可以提高正常受精、胚胎分裂能力。用Ca2+载体离子霉素联合嘌呤霉素的辅助激活方法,可能会使复苏后受精失败的卵母细胞获得正常受精和继续发育的希望,但由于冻融过程对卵母细胞的损伤,与ICSI受精失败的新鲜卵母细胞相比,复苏后受精失败的卵母细胞被补救激活的能力明显下降。（2）慢速冷冻人类成熟卵母细胞,适当提高CPA中蔗糖浓度同样可以明显提高存活率;采用免疫荧光染色和激光共聚焦显微技术（CLSM）可以对单个卵母细胞的纺锤体和染色体结构进行观察;慢速冷冻对人类成熟卵母细胞纺锤体和染色体有一定程度的损伤,复苏后培养适当的时间可以促进部分卵母细胞纺锤体和染色体形态的恢复。