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研究目的卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤死亡的主要原因。虽然早期诊断预后良好,但绝大多数病例诊断为晚期,5年生存率仅为30-40%。这种低存活率主要是由于卵巢癌起始阶段常常缺乏典型的临床症状,大约75%的卵巢癌病人诊断时已经发展为中晚期,常伴远处转移和化疗抵抗,因此深入了解卵巢癌浸润和转移机制,寻找新的肿瘤标记物和治疗靶点是非常重要的。研究方法1.外泌体的提取和鉴定体外培养4种卵巢癌细胞(A2780、UWB、HEY、Anglne)。分别在常氧(5%CO2)和低氧(1%O2)环境下培养,分别收集常氧和低氧条件下的卵巢癌4个细胞系的细胞上清液,通过Exo Isolation Kit提取外泌体,通过透射电子显微镜(TEM)观察Exosomes的形态,纳米颗粒追踪分析技术检测外泌体浓度粒径。采用免疫印迹法分析外泌体(Exosomes)表面特异蛋白CD81和CD63的表达水平。2.筛选差异表达的miRNA及其验证利用高通量技术测序鉴定人类卵巢癌细胞分泌的外泌体miRNA在常氧和低氧环境下的差异表达谱。选取4条miRNA,应用Q-PCR验证测序结果。确定待研的miR-199a-5p并分别在四组卵巢癌细胞系(A2780、UWB、HEY、Anglne)及其分泌的外泌体中验证,征集卵巢癌组织(n=20),同龄人群正常输卵管组织为对照组(n=20),Q-PCR检测miR-199a-5p在组织中的表达。购买卵巢癌患者OC-1601组织芯片,通过荧光原位杂交分析miR-199a-5p的表达水平并与卵巢癌患者临床病理特征(年龄、肿瘤浸润、淋巴结转移、肿瘤分期)进行相关分析。3.miR-199a-5p的生物信息学分析采用包含12个数据库的生物信息学分析软件miRwalk预测miR-199a-5p的靶基因。通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库进行GO分析和KEGG富集分析预测miR-199a-5p靶基因的生物学功能和参与的信号通路。4.miR-199a-5p对卵巢癌细胞的侵袭转移能力的影响及分子机制将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至A2780常氧和低氧培养的细胞系中,通过Transwell侵袭、迁移实验和细胞划痕实验,探讨miR-199a-5p对卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响。通过荧光素酶报告实验,验证HIF-2α 与 miR-199a-5p的相互作用,转染 miR-199a-5p 过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂于A2780细胞,Western Blot技术检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin蛋白的变化,检测HIF-2α、Wnt3a、β-catenin在卵巢癌组织及正常输卵管组织中的表达。免疫组化检测HIF-2α在卵巢癌组织芯片中的表达变化。5.miR-199a-5p通过外泌体传递对血管内皮细胞连接的影响FITC标记miR-199a-5p,PKH26标记卵巢癌细胞分泌的外泌体,与内皮细胞共培养,并在共聚焦显微镜下观察内皮细胞吞噬外泌体。将miR-199a-5p过表达质粒、miR-199a-5p抑制剂分别转染至内皮细胞,通过Western Blot来观察miR-199a-5p对内皮细胞连接蛋白(JAM-A、VE-Cadherin)的影响。并通过免疫组化检测组织芯片中,JAM-A、VE-Cadherin的表达。研究结果1.外泌体的提取和鉴定透射电镜观察到典型的杯状圆形双层膜囊泡。纳米粒子跟踪分析(NTA)显示,这些囊泡的直径范围主要为30～170nm。Western Blot检测显示,Exosome特异性蛋白CD81、CD63阳性。2.miR-199a-5p的筛选和验证高通量测序结果,在卵巢癌细胞系常氧和低氧环境中共找到359条差异表达的miRNA,其中上调的有153条,下调的有206条(FDR<0.05)。选取的4条小RNA,相对于常氧环境,miR-199a-5p,miR-214-5P在低氧环境下相对低表达(miR-199a-5p(Z=-4.438,P=0.0030);miR-214-5P(Z=-4.1828,P=0.0240))。而miR-216a-5p和miR-216b-5p在低氧培养下相对高表达(miR-216a-5P(Z=2.5317,P=0.0064)miR-216b-5p(Z=2.9195,P=0.0053))。Q-PCR验证结果和高通量测序结果一致。选择差异最显著的miR-199a-5p作为研究对象,发现相对于正常输卵管组织,miR-199a-5p在卵巢癌中低表达;miR-199a-5p在卵巢癌细胞系及其分泌的外泌体中,相对于常氧培养,在低氧培养中低表达。原位杂交结果显示,miR-199a-5p在正常输卵管组织显示强荧光,在卵巢癌组织显示弱荧光。miR-199a-5p的表达与卵巢癌临床病理特征关系表明miR-199a-5p的表达与肿瘤浸润(P<0.0010)、淋巴结转移(P<0.0010)、肿瘤TNM分期相关,与年龄无关(P=0.5740)。3.miR-199a-5p的生物信息学分析通过miRwalk数据库中的至少三个数据库,同时预测miR-199a-5p的靶基因,共获得70个候选靶基因,选择和低氧相关的HIF-2α作为miR-199a-5p的潜在靶基因。此外根据候选靶基因分析miR-199a-5p的生物学功能。GO注释富集靶基因的主要分子功能、生物学过程和细胞成分。KEGG信号通路富集靶基因参与了的癌症相关的多个信号通路如Wnt/β-catenin、p13K、NF-κB通路等。4.通过miR-199a-5p-HIF-2α-Wnt/β-catenin轴,来抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移转染miR-199a-5p质粒后卵巢癌细胞A2780在常氧和低氧环境下的侵袭、转移能力明显降低。加入miR-199a-5p抑制剂后,则逆转这一结果。通过生物信息学发现,HIF-2α是miR-199a-5p的潜在靶点。双荧光素酶报告显示:转染HIF-2α野生型的序列后,miR-199a-5p能显著抑制荧光素酶活性,而对HIF-2α突变型的荧光素酶活性无影响,说明了 HIF-2α是miR-199a-5p的直接靶点。免疫印迹实验表明:过表达miR-199a-5p后,可以显著抑制HIF-2α、Wnt3a和β-cateninmRNA在A2780细胞内的表达;而加入miR-199a-5p抑制后,则逆转这以效果,此外相对于正常输卵管组织,HIF-2α、Wnt3a和β-catenin表达在卵巢癌组织中高表达。免疫组化结果显示HIF-2α在卵巢癌组织中染色强阳性,在正常输卵管组织是阴性或弱阳性。相关分析显示卵巢癌组织中HIF-2α与miR-199a-5p的表达存在负性相关。5.外泌体miR-199a-5p可以增强内皮细胞紧密连接共聚焦显微镜显示,内皮细胞可以吞噬卵巢癌A2780细胞分泌的含有miR-199a-5p的外泌体;吞噬miR-199a-5p后内皮细胞的紧密连接标志VE-Cadherin和JAM-A蛋白的表达增加;相比正常输卵管组织,VE-Cadherin和JAM-A在卵巢癌组织中呈阴性或者弱阳性。结论miR-199a-5p在卵巢癌组织中低表达,miR-199a-5p在卵巢癌组织中的表达与临床分期,淋巴结转移和肿瘤浸润相关。低氧微环境下,卵巢癌细胞分泌的外泌体miR-199a-5p的下调促进了卵巢癌细胞的迁移及转移。miR-199a-5p靶基因为HIF-2α,可能通过wnt/β-catenin信号通路发挥作用。卵巢癌来源外泌体miR-199a-5p通过旁分泌作用于血管内皮细胞,其表达下调,可能抑制了内皮细胞之间的紧密连接。