论文部分内容阅读
目的:紫草是我国传统中药,具有清热,解毒的功效。千百年来被用于治疗斑疹,麻疹,咽喉痛,痈以及烧伤。近期内有临床研究表明紫草对于治疗癌症特别是肝癌和肺癌具有较好的效果,本文的目的即是研究紫草有效成分抗癌作用的分子机制。
方法:本课题为研究紫草及其衍生物对癌细胞抑制作用的分子机制,在药理学作用观察方面采用MTT作用于活细胞中的呼吸链,表征药物对细胞增殖的影响,来考查其对癌细胞的的生长抑制作用。同时用DAPI对细胞核进行染色,观察药物作用下癌细胞的细胞核是否呈现染色质边缘化,出现凋亡小体,核固缩等凋亡形态。为进一步研究靶标药物促进癌细胞凋亡的分子机制,采用Ligand Binding分析其与RXR蛋白的配体9-cis的竞争性亲和效应,3H标记的9-cis在闪烁液中的cpm值可以量化紫草中竞争性结合RXR蛋白成分的结合能力。另外Western Blotting的方法研究不同浓度软紫草提取物处理后对癌细胞RXR蛋白稳定性的影响。为选出一个具有代表性的紫草成分及其衍生物,再次采用MTT assay的方法对紫草提取物中的主要成分及其衍生物在不同浓度下对肺癌细胞H460的增殖抑制情况,比较其生长抑制曲线,选择了效果最为明显的SK02作为我们进一步研究的单组分药物,来进行更多的相关实验研究。实验中我们通过转染RXR表达载体进CV-1细胞,筛选得到的一个稳定高表达RXR蛋白的细胞系,通过在该细胞系上进行MTT检测来研究药物对细胞的生长抑制作用与RXR蛋白的关系。同样用3H标记的9-cis确认了SK02与RXR的结合能力后,还采用糜蛋白酶酶切被SK02处理前后的重组RXR-LBD,观察其LBD区域是否会因为其结合而发生构型变化,表现在Western Blot上条带的变化。为进一步研究药物的作用机制,我们采用氯霉素乙酰转移酶报告基因分析(CAT assay)考查靶标药物对RXR蛋白的同源转录激活以及和TR3,RAR的异源转录激活作用:同时用RXRα的表达载体和含RXRα结合位点的CAT报告基因(TREpal)转染CV1细胞,转染后分别用不同浓度的SK02和RXRα的特异性配体SR11237处理24小时,CAT分析检测RXRα的转录效率;同样的在异源转录活性检测中,同时用RXRα的表达载体,表达RAR或者TR3的载体。和含RXRα结合位点的CAT报告基因(TREpal)转染CV1细胞,3H标记的氯霉素乙酰转移酶的转录产物的cpm除以考查转染效率的β-gal值,即是药物影响下的转录效率。
结果:我们发现1紫草粗提物能有效抑制肺癌细胞H460的生长,而同时加入9-cis-RA(RXR的天然配体)减弱了这种生长抑制作用;2配体亲和实验表明紫草粗提物中含有可与RXR结合的成分,在1 ug/ml的浓度下就能把半数结合上去的[3H]9-cis-RA竞争下来;3经过不同浓度的紫草粗提物处理,H460中RXR的含量出现剂量依赖性的下降,说明其对细胞中RXR蛋白稳定性的影响;4进一步研究紫草中作用的主要成分之-SK02组分,发现其对稳定高表达RXR蛋白的CV-1细胞系具有更强的抑制作用;5 SK02其能与9-cis竞争性结合RXR,在10-6M~10-4M间结合能力逐渐增强,小于10-6M结合能力进入平台期;6 SK02与RXR的结合引起RXR LBD结构域的变化,使得其对糜蛋白酶的敏感性增强;7SK02亦能抑制RXR的同源二聚体转录激活,以及与RXR/TR3,RXR/RAR的异源二聚体转录激活作用;8 SK02亦能促进RXR的降解。
结论:紫草的抗癌作用是通过其活性成分与核受体RXR蛋白结合,抑制RXR的转录激活并促进RXR蛋白的降解来实现的。