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β-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽,除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外,它还参与机体免疫反应,有重大的开发利用潜力,当前生物医学的研究热点之一。本研究以鸡β-防御素Gal-1和Gal-6为研究对象,运用分子生物学技术,从安徽三黄鸡骨髓RNA中克隆出Gal-1和Gal-6基因片段,并分别构建pET-28a-Gal-6原核表达载体和pPIC3.5K-Gal-1真核表达载体。研究了重组Gal-6在大肠杆菌系统中高水平表达、重组蛋白的纯化和抗菌活性以及在酵母系统中重组Gal-1的高拷贝菌株筛选。本研究分两部分：1.重组Gal-6在大肠杆菌中高水平表达、纯化和抗菌活性研究从安徽三黄鸡骨髓中提取总RNA,利用设计的引物P1/P2从RNA中扩增Gal-6基因片段,大小约为216bp。将目的基因克隆到pMD-18-T载体中,构建pMD-18-Gal-6克隆载体,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序。经GenBank的BLAST比对,同源性达到100%。利用PCR技术从重组质粒pMD-18-Gal-6中扩增目的片段,并用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,与同样双酶切的质粒pET28a (+)进行连接,从而构建重组表达质粒pET-28a-Gal-6,并在BL21中进行融合表达。Tricine SDS-PAGE电泳表明,表达的Gal-6融合蛋白分子量约为15kD,主要以包涵体形式存在。加入诱导剂1h时,开始检出有蛋白的表达,在5h时其表达水平已接近最大量；诱导剂IPTG在0.2-1.0M范围内,对重组蛋白的产量没有明显影响。融合表达蛋白经过初步分离、变性、复性、镍柱亲和层析纯化,得到纯化蛋白的浓度为0.053mg/mL。对纯化的融合蛋白进行生物学活性检测,结果表明对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都产生抗菌活性。2.Gal-1真核表达质粒的构建和高拷贝菌株筛选利用设计的引物P3/P4从总RNA中扩增Gal-1成熟肽基因片段,大小约为123bp。将目的基因克隆到pMD-18-T载体中,构建pMD-18-Gal-1克隆载体,转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆进行测序。经GenBank的BLAST比对,同源性达到100%。利用PCR技术从重组质粒pMD-18-Gal-1中扩增目的片段,并用BamH I和EcoRl进行双酶切,与同样双酶切的质粒pPIC3.5K进行连接,构建重组表达质粒pPIC3.5K-Gal-1。用Sac I将pPIC3.5K-Gal-1线性化后,电击转入毕赤酵母GS115中。通过G418和实时定量PCR筛选高拷贝转化子,并通过PCR证明其表型。