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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）（简称肝癌）的死亡率在我国恶性肿瘤中列第二位，经几十年努力，在一些肝癌研究中心，肝癌术后10年生存率已从30年前的5％提高到了30％左右。但即使是根治性切除，5年内仍有60～70％的病人出现转移复发，因此探索肝癌转移复发的机制，寻找有效的抑制途径，已成为进一步提高肝癌生存率的关键。 肿瘤血管生成在肝癌转移复发的各个环节中均有重要作用，而“血管异质性”是肿瘤血管研究的热点之一。已有研究表明，血管内皮细胞在不同组织、不同功能状态下可表达特征性的表面分子，而肿瘤组织内的“成血管性内皮细胞”与正常组织内的处于静止状态的内皮细胞相比有许多分子改变。噬菌体文库体内展示技术是研究血管异质性的理想工具，通过噬菌体体内展示技术已成功筛选到针对许多正常组织、肿瘤及一些血管生成相关疾病的特异性靶向分子。但由于肝、脾等属于网状内皮系统的器官存在非特异性吞噬／吸附能力，而一直是噬菌体文库体内展示的“盲区”。 本课题在我所已建立的高转移人肝癌原位移植裸鼠模型上，用改进优化的噬菌体文库体内展示技术筛选肝癌肿瘤血管特异性靶向分子。研究结果表明，改进后的噬菌体文库体内展示技术可成功应用于肝癌肿瘤血管靶向分子的筛选；筛选出的LCI-X7肽可与不同转移潜能或遗传背景的肝癌肿瘤血管特异结合；并可靶向于肝癌肺转移灶；LCI-X7肽还可与部分人肝癌组织肿瘤血管特异结合。实验结果提示：肝癌肿瘤血管具有异质性；肝癌细胞可能具有诱导不同来源肿瘤血管产生相同肝癌特异性标志分子的能力；人肝癌肿瘤血管上可能存在与小鼠同源的特异性标志分子；LCI-X7肽可能在肝癌转移、复发诊断及靶向治疗等方面有较大的潜在应用价值。 第一部分 噬菌体文库体内展示技术的改进及优化 本部分工作的主要目的是研究克服肝脏对噬菌体文库非特异性吞噬／吸附的方法，建立稳定、高效的肝脏（癌）噬菌体文库体内展示技术平台。 1．噬菌体体内分布及代谢实验：尾静脉注射噬菌体到裸鼠体内，应用抗噬菌体免疫组化染色及组织滴度测定等方法研究注射后不同时间噬菌体在裸鼠体内的分布及代谢规律；实验结果表明，噬菌体主要经肝、肾代谢，肝脏和肿瘤博士论文中文摘要 可非特异性地结合噬菌体，与噬菌体展示的多肤无关。2.活体灌洗技术比较实验:研究不同活体灌洗方法对组织中噬菌体分布的影响。 结果表明，改进后的灌洗技术可较单纯左心室灌洗显著减少组织血管中血液 及未结合噬菌体的残留，从而提高噬菌体文库体内展示的效率。3.聚肌昔(PolyD抑制实验:将不同剂量的Polyl先于噬菌体尾静脉注射荷肝 癌裸鼠体内，检测噬菌体在各组织中的分布;实验结果提示，Polyl不能有 效降低肝脏和肿瘤对噬菌体的非特异性吞噬/吸附。4.噬菌体饱和灌注实验:以不同剂量空白噬菌体注入荷瘤裸鼠，检测组织中噬 菌体的分布;并研究“过量”空白噬菌体预灌注后文库噬菌体分布规律。实 验结果表明，肝脏和肿瘤的非特异性结合噬菌体能力存在饱和现象，空白噬 菌体预饱和可有效抑制肝脏和肿瘤组织对文库噬菌体的非特异性结合。5.激光捕获显微切割（LCM）技术在体内噬菌体展示中的应用及优化:以LCM 技术获取纯肿瘤血管内皮细胞，并对LCM前后的染色、噬菌体复苏等步骤 进行优化。实验结果表明，LCM可显著提高体内噬菌体展示的筛选效率。6.实时定量PCR（Real一Time PCR）在噬菌体展示中的应用:优化反应条件，用 实时定量PCR方法检测组织中噬菌体滴度，不仅增加了结果的可靠性，还使 效率大大提高。7.绿色荧光高/低转移人肝癌细胞株（MHCC97一HG乃涯HCC97一LG）的建立及鉴 定:为观察肝癌转移情况及肝癌肿瘤血管靶向分子与肿瘤的结合效率，我们 用脂质体转染法将绿色荧光蛋白（GFP）基因导入MHCC97一H及MHCC97一L 细胞株中，体外G418筛选单克隆化，建立了可在体内、外稳定表达GFP的 绿色荧光高/低转移人肝癌细胞株（MHCC97一HG乃吐HCC97一LG），并维持了其 父系的转移特性。第二部分肝癌肿瘤血管特异性靶向分子的筛选和鉴定 利用改进优化的噬菌体文库体内展示技术，在荷肝癌（MHCC97一H）裸鼠上筛选与肝癌肿瘤血管特异结合的靶向多肤。经六轮体内筛选得到一个可特异结合肝癌肿瘤血管的噬菌体（命名为“LCI一X7”噬菌体），人工合成其展示的7肤:Leu一Pro一Asn一Ile一ser-Lys一Pro（LPNIs对，命名为“LCI一X7”肤）及对照7肤（相同氨基酸组分但随机排列，IPSPLKN），予丹磺酞氯（Dansyl chforide，DNS）标记，并经各种体内、外实验鉴定其与肝癌肿瘤血管结合的特异性。1.肝癌肿瘤血管特异性靶向分子的体内筛选:利用前面已建立的噬菌体文库体 内展示技术在荷肝癌（MHCC97一H）裸鼠上体内筛选肝癌肿瘤血管靶向分子，博士论文中文摘要 重复筛选步骤共6轮。实验结果显示，通过改进的噬菌体文库体内展示技术 成功筛选到肝癌肿瘤血管特异性靶向分子，展示“LCI一X了”肤的一个噬菌体 被高度富集。2.肝癌肿瘤血管结合实验:我们在8个不同肝癌细胞株(HeP3B、PLc加RF/5