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对国内H9N2分离株NA蛋白的序列分析发现,最近国内H9N2分离株NA蛋白在264位出现了一个潜在的N-糖基化位点。2000年-2013年间,携带该位点的H9N2病毒成逐渐增多趋势,但是2013年之后有所减少。值得注意的是,具有该N-糖基化位点的H9N2毒株仅被分离于中国,其它国家只零星存在。这些分析与发现提示具有该N-糖基化位点的H9N2病毒的出现与流行,可能与国内H9N2病毒的大范围免疫有关。然而,目前国内外对这一潜在的N-糖基化位点的功能和作用尚无研究报道。本研究利用反向遗传操作技术,以NA蛋白264位存在潜在糖基化位点的A/Chicken/Jiangsu/WS1/2012(H9N2) (WS1)病毒以及NA蛋白264位不存在潜在糖基化位点的A/chicken/Beijing/BJ1/2004(H9N2)(BJ)病毒为研究对象,分别拯救出了rgWSl-NA264N, rgWSl-NA264H, rgBJ-NA264H和rgBJ-NA264N 四个病毒,并在体内外对该潜在糖基化位点对H9N2病毒特性的影响进行了研究。1.H9N2禽流感病毒NA264N及其变体病毒的拯救本研究在发现国内H9N2分离株NA蛋白264位存在潜在N-糖基化位点且该位点呈流行趋势的基础上,为研究该位点对H9N2病毒特性的影响,以WS1病毒和BJ病毒为研究对象,利用重组酶ExnaseTM Ⅱ克隆技术以及流感病毒反向遗传操作技术,成功构建出了可以拯救WS1病毒的8质粒系统以及BJ病毒的HA和NA基因,各质粒分别命名为WS1-PB2,WS1-PA, WS1-PB1, WS1-HA, WS1-, NP, WS1-NA, WS1-MP, WS1-NS, BJ-HA, BJ-NA。与此同时,本研究利用Overlap PCR突变技术构建了NA基因的两个变体,命名为WS1-NA264H, BJ-NA264N。通过8质粒转染293T及MDCK细胞,成功拯救出了四个病毒,分别命名为rgWS1-NA264N, rgWS1-NA264H, rgBJ-NA264H 和 rgBJ-NA264N。病毒效价分别为1.58×10-7 TCIDso/m1,5×10-7 TCID50/ml,1.08×10-7 TCID50/ml,1.58×10-7 TCID50/ml。这些病毒的成功拯救为研究H9N2禽流感病毒NA蛋白264位潜在糖基化位点对病毒特性的影响提供了重要材料。2. NA264N对H9N2禽流感病毒特性的影响为研究NA蛋白264位潜在糖基化位点对H9N2病毒特性的影响,本研究以上述拯救出的四个病毒(rgWSl-NA264N, rgWSl-NA264H, rgBJ-NA264H, rgBJ-NA264N)为研究对象,通过体内外试验研究NA蛋白264位潜在糖基化位点对H9N2病毒复制、排毒及致病性等方面的影响。病毒的体外生长曲线表明,rgWSl-NA264H以及rgBJ-NA264H均比相应的rgWSl-NA264N及rgBJ-NA264N在MDCK细胞上生长得快些。在小鼠致病性试验中,虽然rgWSl-NA264H与rgWSl-NA264N病毒在小鼠肺部的含量无显著差异且这两株病毒引起小鼠的体重下降也无明显差异,但是rgBJ-NA264H病毒在小鼠肺部的含量却显著高于rgBJ-NA264N病毒(3dpi),rgBJ-NA264H感染小鼠平均体重下降最高达20%,而rgBJ-NA264N感染小鼠体重下降最高仅10%。感染鸡喉头排毒试验表明,rgWSl-NA264H以及rgBJ-NA264H均比相应的rgWSl-NA264N及rgBJ-NA264N排毒多。在接触感染组中,虽然rgWSl-NA264H与rgWSl-NA264N喉头排毒量无显著差异,但是rgBJ-NA264H的喉头排毒量显著高于rgBJ-NA264N (6dpi).这些试验结果表明,H9N2禽流感病毒NA蛋白264位潜在糖基化位点在一定程度上会影响H9N2病毒的复制、排毒及其致病性。