意大利青霉（Penicillium italicum）在柑橘的采后贮藏、运输期间引起大批量的果实腐烂,给农业生产带来巨大的经济损失,为了有效控制该病害,需对其致病机制进行探究。研究表明,意大利青霉在侵染柑橘时,会分泌大量的酸来改变环境pH值,破坏宿主防御系统,其通过PAL信号传导途径感应外界pH值,通过信号传导,激活关键转录因子PacC,对pH环境作出响应。本文通过建立农杆菌介导意大利青霉pacC基因敲除的转化体系,并通过转化得到了△pacC突变株。为探索意大利青霉pacC基因的功能,从而进一步探究意大利青霉的致病机理奠定基础。主要研究结果如下:1.pacC基因敲除载体构建:本研究采用融合PCR技术,设计具有互补末端的引物,通过PCR产物重叠链的延伸,将目的基因pacC的上游序列、潮霉素B抗性基因与目的基因pacC的下游序列融合成一个片段。得到重组片段后,以pMD19-T为中间载体,通过酶切酶连,最终将重组片段连接至pCAMBI3300,成功构建基因敲除载体pACC3300。2.根癌农杆菌介导意大利青霉转化体系的建立与优化:探讨了孢子悬浮液浓度、农杆菌种类、共培养时间、共培养温度、预诱导时AS的添加、承载膜的种类以及抗生素浓度对根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化体系中的影响,确定了较优的转化条件:孢子悬浮液浓度在1x10~5-1x10~6cfu/mL,与AS预诱导的含敲除载体的农杆菌等比例混合,涂布在承载膜为玻璃纸的Co-IM培养基上,25℃共培养36 h后,将玻璃纸转移至含浓度为50μg/mL潮霉素B和200μg/mL头孢霉素的PDA培养基上培养,可得到较多的单菌落转化子,说明其为较优转化体系。随机挑选转化子在不含抗生素PDA培养基上传代5次后,转化子仍能在抗生素平板中生长,PCR验证转化子保留潮霉素B抗性基因,表明该体系是高效、稳定的遗传转化体系。3.△pacC突变株的获得通过根癌农杆菌介导转化将敲除载体携带的重组片段整合至意大利青霉的基因组中,共得到346个转化子。提取转化子的DNA,并进行PCR验证,其中有两株转化子不含有pacC基因,且含有潮霉素B抗性基因。这表明成功获得了两株△pacC突变株,为后续研究pacC在意大利青霉侵染柑橘发挥的功能奠定基础。