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鹿瓜多肽注射液是哈尔滨誉衡药业的独家原研专利品种,为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temmick的骨骼与葫芦科植物甜瓜Cucumis melo L.的干燥成熟种子经分别提取后制成的灭菌水溶液。目前其药效物质基础不明确,质量控制水平较低,制约了其扩大生产销售规模以及临床安全应用。本课题组在前人研究的基础上采用纳升级高效液相色谱仪-线性离子阱-静电场轨道阱蛋白质分析系统（NanoLC-LTQ-Orbitrap）对梅花鹿骨以及甜瓜子提取物进行检测分析,多种柱色谱填料对其中的化学成分进行分离纯化,并采用LCMS-IT-TOF,NMR以及MALDI-TOF-MS等技术对所分离得到的成分进行结构鉴定。除此之外,还利用HPLC-ELSD、分级沉淀法、苯酚硫酸法对甜瓜子以及鹿瓜多肽冻干粉中的单糖,多糖进行定性定量分析,采用氨基酸分析仪对甜瓜子以及鹿骨提取物中的氨基酸类成分进行分析。取得了以下研究结果:一、通过系统查阅国内外文献,对鹿瓜多肽注射液的临床应用和药理学研究进展以及多肽类化合物的分离纯化、结构鉴定技术进行了综述。文献研究表明,鹿瓜多肽注射液在临床上主要用于治疗骨质疏松、类风湿性关节炎、骨折不愈合以及强直性脊柱炎等症状,治疗作用良好,不良反应发生率较低。经现代药理学研究发现,鹿瓜多肽注射液具有抗炎、促进骨细胞生长、抑制骨质疏松等作用。在多肽的分离纯化以及结构鉴定研究方面,目前国内外学者主要采用色谱技术、电泳技术以及膜分离技术对多肽进行分离纯化;采用末端降解技术、基于MALDI以及ESI的质谱技术对多肽的氨基酸残基序列进行分析。二、采用NanoLC-LTQ-Orbitrap对梅花鹿骨多肽冻干粉进行检测,发现其中存在大量肽类化合物的质谱信号。通过数据库检索一级精确分子量以及二级质谱信息,匹配得到43个多肽序列。随后采用多种填料柱色谱以及半制备液相对鹿骨提取物中的多肽类化合物进行分离纯化,并采用MALDI-TOF-MS等技术对分离得到的多肽类化合物的一级氨基酸序列进行测序,共从鹿骨提取物中鉴定了 13个多肽类化合物的氨基酸一级序列,分别为 GPVGPTGPVGAAGPSGPD（梅花鹿骨 18 肽,1）,AGPAGPLGPLGPLGPLGPPDSYD（梅花鹿骨 23 肽,2）,AGPAGPKGELGSLGE（梅花鹿骨15肽1,3）,第9位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGE（梅花鹿骨15肽2,4）,第9、15位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGE（梅花鹿骨15肽3,5）,第7位乙烯基修饰和第9位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGE（梅花鹿骨15肽4,6）,第7位乙烯基修饰和第9、15位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGE（梅花鹿骨15肽5,7）,AGPAGPKGELGSLGED（梅花鹿骨16肽1,8）,第9位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGED（梅花鹿骨16肽2,9）,第9、15位甲基化修饰的AGPAGPKGELGSLGED（梅花鹿骨 16肽 3,10）,PGLGALAPYPD（梅花鹿骨 11 肽,11）;LGPLGPAGFAGPLGAD（梅花鹿骨 16肽 4;12）,LGPAGKEGPVGLLGL（梅花鹿骨15肽6,13）。三、采用纳升级高效液相色谱仪-线性离子阱-静电场轨道阱蛋白质分析系统（NanoLC-LTQ-Orbitrap）对甜瓜子提取物进行检测分析,发现其中肽类化合物含量很少。随后采用多种填料柱色谱以及半制备液相对甜瓜子提取物中的小分子化合物进行分离纯化,并采用LCMS-IT-TOF以及NMR对分离得到的化合物进行结构鉴定,共从甜瓜子提取物中分离鉴定了 8个化合物,分别为对羟基苯丙三醇（1）,愈创木基丙三醇（2）,N5-（4’-hydroxybenzyl）-L-glutamine（3）,（E）-对-香豆醇（4）,松柏醇（5）,苯丙氨酸（6）,尿嘧啶（7）和胸腺嘧啶（8）。化合物1-5均为首次从黄瓜属植物中分离得到。四、采用HPLC-ELSD对甜瓜子提取物和鹿瓜多肽冻干粉中主要含有的四种糖类成分,即果糖、半乳糖、蔗糖以及棉子糖进行含量测定。三个不同批次的甜瓜子提取物以及一批次的鹿瓜多肽冻干粉中四种糖的总含量分别为145.1 μg·mg-1,255.8μg·mg-1,163.1 μg·mg-1,153.7 μg·mg-1;苯酚硫酸法测得的还原糖含量分别为31.4%,34.9%,32.1%,19.6%;经分级沉淀法测得三个批次甜瓜子提取物中多糖含量分别为51.6%,53.6%,52.9%。随后还对三个批次甜瓜子提取物、梅花鹿骨多肽冻干粉以及一批次的鹿瓜多肽冻干粉中氨基酸类成分进行分析,经氨基酸分析仪测得游离氨基酸含量分别为 6.4μg·mg-1,20.1 μg·mg-1,10.1 μg·mg-1,51.3 μg·mg-1,44.1 μg·mg-1,52.4μg·mg-1,35.7 μg·mg-1;经酸水解后测得的总氨基酸含量分别为131.7 μg·mg-1,138.4μg·mg-1,113.3 μg·mg-1,694.4 μg·mg-1,724.5 μg·mg-1,747.0 μg·mg-1,363.2μg·mg-1。