研究背景心血管疾病中急性心肌梗死一直以来是导致中老年人致死和致残的主要因素之一,并逐渐呈年轻化趋势。再灌注治疗的及时运用能减轻急性心肌梗死后心肌细胞的死亡,但也引起心肌缺血再灌注损伤。如何采取各种措施减轻心肌缺血再灌注损伤,成为研究的热点。研究表明缺血预处理与后处理均能减轻心肌缺血再灌注损伤,由于急性心肌梗死在临床上的不可预见性,与缺血预处理相比,缺血后处理在临床上的运用更具可操作性。此外,在再灌注的起始阶段进行药物性干预称为药物后处理,因其能达到缺血后处理类似的心肌保护作用而受到广泛关注。与缺血后处理相比,在临床上,药物后处理具有无创性且更加可控,其心肌保护作用更加明显且应用范围更加广泛。虎杖苷(polydatin, PD)是从蓼科植物虎杖根中提取的一种天然的单体,是白藜芦醇的衍生物,能改善微循环,抑制溶酶体酶的释放,具有抗氧化,阻止微循环中白细胞粘附,抗炎等作用。研究表明虎杖苷对心血管系统具有多种药理作用,如减轻压力负荷引起的心室重构和心肌肥厚。此外,在缺血前用虎杖苷预处理能明显减轻心肌缺血导致的损伤。但虎杖苷后处理对心肌缺血再灌注损伤的作用尚不明确。自噬是一种可控的,依赖细胞内溶酶体将损伤的大物质(如线粒体,难降解的蛋白等)进行降解的过程。自噬在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用,基础水平的自噬对细胞内环境及细胞稳态起重要作用。研究报道白藜芦醇预处理在心肌缺血再灌注过程中通过上调自噬起心肌保护作用。我们提出假说：虎杖苷后处理可能通过促进自噬流的发生减轻心肌缺血再灌注损伤。研究目的1.在动物心肌缺血再灌注模型及原代心肌细胞缺氧复氧模型中,证实虎杖苷在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用。2.在原代心肌细胞缺氧复氧模型中,探究虎杖苷在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制。研究方法体内实验体内实验选用野生型C57BL/6雄性小鼠(6至8周龄,体重20-25g),小鼠心肌缺血再灌注损伤模型的构建是结扎冠状动脉左前降支30分钟后解除结扎线进行2小时灌注。体内实验包括使用不同虎杖苷浓度的预实验,及选取最佳浓度后的正式实验。预实验中,实验对象被随机分成5组：假手术组(sham组)、缺血再灌注加生理盐水组(I/R+NS组)、缺血再灌注加5mg/kg虎杖苷组(I/R+PD5组)、缺血再灌注加7.5 mg/kg虎杖苷组(I/R+PD 7.5组)、缺血再灌注加10 mg/kg虎杖苷组(I/R+PD 10组)。用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平及用蛋白免疫印迹技术检测各组中自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达情况。确定虎杖苷最佳药物剂量7.5mg/kg后,小鼠被随机分成组：假手术组(sham组)、缺血再灌注加生理盐水组(I/R+NS组)、缺血再灌注加虎杖苷组(I/R+PD组)、缺血再灌注加虎杖苷加自噬抑制剂组(I/R+PD+3-MA组)、缺血再灌注加自噬抑制剂组I/R+3-MA组)。结扎冠状动脉左前降支30分钟后解除结扎线再灌注2小时,建立小鼠心肌缺血再灌注模型。于结扎冠状动脉左前降支15分钟后,通过腹腔注射一定浓度的药物(生理盐水或虎杖苷或自噬抑制剂)。提取各组心脏组织进行蛋白免疫印迹分析,电镜观察心肌细胞超微结构,用TTC-Evans blue双染检测心肌梗死面积,用小动物超声技术检测心脏功能。体外实验体外实验是在SD大鼠乳鼠原代心肌细胞中,模拟体内心肌缺血再灌注过程,建立原代心肌细胞缺氧复氧模型。本实验主要采用胰酶胶原酶消化法获取乳鼠原代心肌细胞,通过差速培养法及Brdu抑制法抑制成纤维细胞,分离培养心肌细胞。预实验中,培养的心肌细胞随机分为对照组(control组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧加1μM虎杖苷组(H/R+PD 1组)、缺氧复氧加10μM虎杖苷组(H/R+PD 10组)、缺氧复氧加100μM虎杖苷组(H/R+PD 100组)。观察心肌细胞搏动和形态学变化；用MTS法检测心肌细胞活力；用蛋白免疫印迹技术检测各组中自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达情况。确定虎杖苷最佳浓度为10μM后,设定以下实验分组：对照组(control组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧加虎杖苷组(H/R+PD组)、缺氧复氧加虎杖苷加自噬抑制剂组(H/R+PD+3-MA或H/R+PD+Bafilomycin A1组)、缺氧复氧加自噬抑制剂组(H/R+3-MA或H/R+Bafilomycin A1组)。提取各组细胞蛋白进行蛋白免疫印迹分析；用GFP-mRFP双标LC3的腺病毒转染细胞后,检测自噬流的水平；用TUNEL染色法分析细胞凋亡水平：用电镜观察心肌细胞超微结构：分别用JC-1染色及Rho123染色后共聚焦显微镜及流式细胞术检测细胞线粒体损伤水平；分别用DCFH-DA及DHE荧光探针标记后,使用共聚焦显微镜及流式细胞术检测细胞中活性氧的水平。此外,在原代心肌细胞中转染自噬关键蛋白Beclinl使之表达下调,进一步验证原代心肌细胞中自噬及凋亡的水平。所有数据均采用SPSS 19.0专业软件进行统计学分析,所有数值用均数±标准差(x±s)表示。采用One-way ANOVA进行方差分析,所有数据均进行方差齐性检验,若方差齐,则组间比较用方差分析,两两比较用最小显著差异法(least significiant difference, LSD)方法；当方差不齐时,组间比较采用Welch法进行近似方差分析,两两比较用Bonferroni或Dunnett’s T3。 P< 0.05被认为差异具有统计学意义。研究结果1.不同浓度虎杖苷后处理对心肌缺血再灌注损伤的作用(1)虎杖苷后处理增加心肌细胞存活率。细胞活性经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.052)；用LSD法进行组间比较。H/R组与对照组相比,细胞存活率明显减少(P<0.001 vs.C组, n=3)； 虎杖苷各浓度处理组与H/R组相比,细胞存活率明显增加(P< 0.001 vs. H/R组)。高浓度组与中浓度组中细胞存活率差异无统计学意义(P=1.0,PD 10 vs. PD 100组)。(2)虎杖苷后处理减少小鼠心肌细胞凋亡。TUNEL阳性细胞数经Levene法方差分析显示方差不齐(P<0.001)；用Welch法进行近似方差分析(P<0.001)。I/R组与假手术组相比,TUNEL阳性细胞数明显减少(P< 0.001 vs. sham组,n=40,每组四只,每只选取10个视野)；虎杖苷各浓度处理组与I/R组相比,TUNEL阳性细胞数明显减少(P< 0.001 vs. I/R组)。高浓度组与中浓度组中TUNEL阳性细胞数差异无统计学意义(P=0.999)。(3)虎杖苷后处理使心肌细胞中自噬相关蛋白表达增加,凋亡相关蛋白表达减少。在体外实验中：LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.26)；用LSD法进行各组间比较。1μM PD与10μM PD处理组明显增加LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值(P< 0.001 vs. H/R组,n= 4)。 LC3 Ⅱ/GAPDH经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.002)；用Bonferroni法进行各组间比较。PD 10组与H/R组相比,LC3 Ⅱ/GAPDH表达水平明显下降(P= 0.005 vs. H/R组,n=4). p62/GAPDH表达水平经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.001)；用Welch法进行近似方差分析(P<0.001),用Bonferrion法进行组间两两比较。10μM PD,100μ M PD组与H/R组相比,p62表达量表达下降(P<0.001 vs. H/R组,n= 3)。Cleaved caspase-3经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.663)；用LSD法进行各组间比较。PD各浓度组与H/R组相比,Cleaved caspase-3表达明显减小(P< 0.01 vs. H/R组);10μ M PD与100μ M PD组相比,差异无统计学意义(P= 0.213,PD 10 vs.PD100, n=6)。在体内实验中：LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.054)；用LSD法进行各组间比较。各浓度PD (5,7.5, 10mg/kg)处理组明显增加LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值(P< 0.05 vs. I/R+NS组,n= 3)。 7.5mg/kg PD组比值与5mg/kg PD组无统计学意义(P=0.115),但小于10mg/kg PD组(P=0.002)。LC3 Ⅱ/GAPDH经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.118)；用LSD法进行各组间比较。PD各浓度组与I/R+NS组相比,LC3 Ⅱ/GAPDH表达水平明显下降(P< 0.05 vs. I/R+NS组,n= 3)。 7.5mg/kg PD组比值与5mg/kg PD组无统计学意义(P= 0.209, PD 7.5 vs. PD 5),但小于10mg/kg PD组(P= 0.009, PD 7.5 vs.PD10)。 p62/GAPDH表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.267)；用LSD法进行组间两两比较。各浓度PD (5,7.5, 10mg/kg)处理组明显减少p62的表达(P<0.05 vs. I/R+NS组,n= 3)。 Cleaved caspase-3经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.387)；用LSD法进行各组间比较。PD各浓度组与I/R+NS组相比,Cleaved caspase-3表达明显减小(P< 0.001 vs. I/R+NS组)。结果表明：各浓度PD均能减轻心肌细胞凋亡,增加存活率,并增加自噬相关蛋白表达,减少凋亡相关蛋白表达,综合以上结果,分别选取10μM及7.5 mg/kg作为体外及体内实验的最佳浓度。2.虎杖苷后处理对缺血再灌注损伤起保护作用(1)虎杖苷后处理减少小鼠心肌细胞线粒体损伤及线粒体肿胀。电子显微镜结果显示对照组中线粒体结构完整,线粒体脊排列完整；而缺血灌注组中可见线粒体明显肿胀,可见线粒体脊部分消失；虎杖苷后处理明显改善线粒体超微结构损伤,肿胀的线粒体体积缩小,线粒体脊排列较完整。线粒体平均面积经Levene法方差分析显示方差不齐(P<0.001,)；用Welch法进行近似方差分析(P< 0.001)。I/R组与sham组相比,线粒体平均面积明显增加(P< 0.001 vs. sham组, n=40);PD后处理组明显减少线粒体平均面积(P< 0.001, I/R+PD vs. I/R+NS组)。加入自噬抑制剂3-MA后,线粒体平均面积增加(P< 0.001, I/R+ 3-MA+PD vs. I/R+PD组)。(2)PD后处理明显减少心肌梗死面积。IS/AAR经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.043)；采用类似方差分析方法分析。I/R组与sham组相比,心肌梗死面积明显增加(P< 0.001, I/R+NS vs. sham组, n=5)；PD后处理组明显减轻心肌梗死面积(P< 0.001, I/R+PD vs. I/R+NS组)。加入自噬抑制剂3-MA后,心肌梗死面积增加(P=0.001,I/R+3.MA+PD vs.I/R+PD组)。AAR/LV经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.209);AAR/LV各组间比较无明显差异(P>0.005)。(3)PD后处理明显改善心功能。射血分数(EF)经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.4)；采用类似方差分析方法分析(P<0.001).I/R组与sham组相比,射血分数明显减少(P<0.001,I/R+NS vs.sham组,n=5)；PD后处理增加心脏射血分数(P:0.008,I/R+PD vs.I/R+NS组)。加入自噬抑制剂3-MA后,心脏射血分数减少(P=0.018,I/R+3.MA+PD vs.I/R+PD组)。左室短轴缩短率(LVFS)经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.819)；采用LSD方法进行各组间比较,各组间差异无统计学意义(P>0.005)。虎杖苷后处理增加自噬表达水平。结果表明：PD后处理能改善缺血再灌注损伤引起的超微结构损伤,能减少梗死面积,明显改善心功能。3. 虎杖苷后处理对自噬及凋亡的影响(1)虎杖苷后处理增加自噬,抑制凋亡。体内实验中：LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.527)； 用LSD法进行各组间比较。PD后处理明显增加LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值(P<O.001,I/R+PD vs.I/R+NS组,n=3),而加入自噬抑制剂3-MA则使LC3 Ⅱ/Ⅰ水平下降(P<0.001,I/R+3-MA+PD vs.I/R+3-MA组)。LC3 Ⅱ/GAPDH经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.092)；用LSD法进行各组间比较。PD后处理明显增加LC3 II的表达(P=0.006 vs.I/R+NS组,n=3),而加入自噬抑制剂3-MA则使LC3 II表达下降(P:0.001.I/R+PD+3-MA组vs.I/R+3-MA组)。Cleaved caspase-3经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.126)； 用LSD法进行各组间比较。PD后处理明显增加Cleaved caspase-3的表达水平(P=0.016,I/R+PD vs.I/R+NS组, n=3)。体外实验中：LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.613)；用LSD法进行各组间比较。H/R组转染Beclin 1干扰的病毒后LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达明显降低(P=0.005, H/R vs.H/R+sh.B组,n=3),PD后处理组中转染Beclin 1干扰的病毒后亦使LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达也明显降低(P<0.001,H/R+PD vs.H/R+PD+sh-B组)。LC3 Ⅱ蛋白表达水平经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.079)； 用LSD法进行各组间比较。H/R组转染Beclin 1干扰的病毒后LC3 II的表达明显降低(P:0.001, H/R vs.H/R+sh.B组,n=3),PD后处理组中转染Beclin 1干扰的病毒后亦使LC3 II的表达降低(P<0.001,H/R+PD vs. H/R+PD+sh-B组)。(2)自噬抑制剂部分抵消虎杖苷后处理引起的细胞保护作用。细胞活性经Levene法方差分析显示方差齐(P=0.286)； 用LSD法进行组间比较。转染Beclin 1干扰病毒组与阴性对照组相比,细胞存活率明显减少(P<0.001 vs.NC组, n=3)。4.虎杖苷后处理促进自噬流的顺利进行自噬的发生是一个动态的过程,自噬发生的过程包括自噬前体的形成,自噬体的形成,自噬体与溶酶体的融合以及自噬溶酶体的降解。自噬的表达增加可能是自噬体形成的增加或者是自噬溶酶体降解的减少,为进一步验证虎杖苷主要影响的是自噬发生的哪个过程。我们在原代心肌细胞中转染携带GFP-mRFP-LC3的腺病毒,观察自噬体(AP)及自噬溶酶体(AL)的变化。AP数量经Levene法方差分析显示方差不齐(P<0.001)； 用Welch法进行近似方差分析(P<0.001)。H/R组与对照组相比,AP数量明显增加(P<0.001 vs.C组,n=40)。AL经Levene法方差分析显示方差不齐(P<0.001,)； 用Welch法进行近似方差分析(P<0.001).H/R+PD组与H/R组相比,自噬体数量明显增加(P<0.001 vs.H/R组, n=40)。加入自噬体抑制剂3-MA后,AP及AL均明显减少(P<0.001,H/R+3-MA+PD vs.H/R+PD组)。为进一步验证虎杖苷影响自噬发生的过程,我们在心肌细胞中加入溶酶体抑制剂(Bafilomycin A1). Western blot结果显示加入Bafilomycin Al后,蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ及LC3 Ⅱ的水平均明显增加(P<0.001,H/R+Baf vs.H/R+PD+Baf组),说明虎杖苷主要促进AL的降解,即促进自噬流的发生。并用TUNEL方法检测细胞的凋亡水平。TUNEL经Levene法方差分析显示方差不齐(P<0.001,)；用Welch法进行近似方差分析(P<0.001)。H/R组与对照组相比,细胞凋亡增加(P<0.001 vs.C组, n=40)。虎杖苷减少细胞凋亡(P<0.001 vs.H/R组),溶酶体抑制剂Bafilomycin A1则抵消虎杖苷的部分保护作用(P<0.001,H/R+Baf vs.H/R+ PD+Baf组)。结果表明：虎杖苷后处理促进自噬流的发生,并减少细胞凋亡。5.虎杖苷后处理对线粒体及ROS水平的影响。5.1虎杖苷后处理对线粒体的影响自噬发生时能够包裹损伤的线粒体,通过降解损伤的线粒体等并转化为能量,为周边的细胞提供能量。结果显示虎杖苷增加自噬流的发生,则进一步检测虎杖苷后处理后对损伤线粒体的影响。电镜超微结构显示对照组中线粒体结构完整,线粒体脊排列完整,少见或未见损伤的线粒体；而缺血灌注组中可见线粒体明显肿胀,可见线粒体脊部分消失,损伤线粒体较多；虎杖苷后处理明显改善线粒体超微结构损伤,肿胀的线粒体体积缩小,线粒体脊排列较完整。线粒体膜电位经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.024)。用Bonferrion法进行组间两两比较,H/R处理后线粒体膜电位明显下降(P<0.001 vs.C组,n=3);H/R+PD组与H/R组相比,线粒体膜电位增加(P<0.001 vs.H/R组, n=3)；而Baafulomycin A1则使膜电位增加(P<0.001,H/R+Baf vs.H/R+PD+Baf组)。5.2虎杖苷后处理对ROS水平的影响损伤的线粒体是ROS产生的主要来源,结果显示虎杖苷后处理线粒体损伤明显减轻,我们进一步检测了细胞内ROS的水平。ROS中的H202经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.019)。用Bonferrion法进行组间两两比较,H/R处理后H202表达水平增加(P=0.001 vs.C组,n=3):H/R+PD组与H/R组相比,H202表达水平下降(P=0.009 vs.H/R组,n=3). ROS中的H202水平经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.019)。用Bonferrion法进行组间两两比较,H/R处理后H202表达水平增加(P=0.001 vs.C组,n=3):H/R+PD组与H/R组相比,H2O2表达水平下降(P=0.009 vs.H/R组,n=3). ROS中的超氧化物(O-)水平经Levene法方差分析显示方差不齐(P=0.105)。用Bonferrion法进行组间两两比较,H/R处理后O-表达水平增加(P<0.001 vs.C组,n:3);H/R+PD组与H/R组相比,O-表达水平下降(P=0.013 vs.H/R组, n=3)。结果表明：虎杖苷后处理减轻线粒体损伤及减少细胞内ROS。结论虎杖苷后处理通过增加自噬流,减少凋亡,减轻线粒体损伤及降低ROS水平,减轻心肌缺血再灌注损伤。