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最初发现Skp(S-phas.Kinas.associate.Protein)蛋白与cyclinA-CDK复合物在细胞S期相互作用,故称为S期激酶相关蛋白。它是F-box蛋白的一种,参与生物的泛素化过程。目前Skp蛋白在许多动植物中都有发现,尤其在人类的许多癌症中都有研究。但在家蚕中尚未有报道。Skp蛋白中研究较多的是Skp2蛋白,Skp2以细胞周期依赖的形式在G晚期开始出现,S/G期高表达,然后其mRNA和蛋白水平迅速下降。目前研究表明Skp2的表达受转录及转录后水平双重调节,且在不同类型的细胞中起主导作用的调节机制不同。
从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得一条基因序列,经NCBI序列比对后推测是家蚕S期激酶相关蛋白,并命名为BmSkp。该基因ORF共59.bp,无内含子,编码198个氨基酸。Blastp比对结果表明BmSkp蛋白包含3个保守结构域Skpl,预测蛋白分子量为22.32.kD,等电点为4.40,是一个酸性亲水性蛋白。将BmSkp基因插入到pET-28a的Eco.I和Xh.I两个酶切位点间,得到融合蛋白表达质粒pET-28a-BmSkp。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,活化重组菌,用终浓度为1 mM的IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳分析,在2.kD左右发现一条特异性蛋白条带,与目的蛋白大小相符(His-tag为3.5.kD,BmSkp预测为22.32.kD)。我们采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白。以纯化所得高纯度蛋白为抗原免疫雄性新西兰大白兔,制备该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:21800以上,免疫印迹检测表明抗体有较高的特异性,说明抗体有效,可以进行下一步相关免疫实验。提取家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织的总RNA和总蛋白,分别用荧光定量PCR和Wester.blotting技术检测BmSkp蛋白在家蚕中的转录及表达水平。实验结果表明,BmSkp基因在家蚕四个发育时期中的转录情况存在较大差异,其中,蛾中最高,卵中最低。在家蚕五龄幼虫各组织中的转录情况也存在较大的差异,由高到低依次为:睾丸、气门、头、肠、表皮、脂肪体、马氏管、丝腺。BmSkp蛋白在家蚕各个生长发育时期几乎都存在,以卵和成体中含量最多,由此推测BmSkp蛋白可能对家蚕的生长发育起着重要的调控作用。对家蚕Bm5细胞进行免疫细胞定位,结果表明BmSkp蛋白主要存在于细胞质中,细胞核中有少量。为了进一步研究B.Skp基因在细胞中作用,我们进行了RNA干扰实验,结果表明将BmSkp基因沉默后,细胞增长受到抑制。