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三七是我国传统的中药,为五加科人参属多年生草本植物三七的根,主产于我国云南、广西。因其与名贵药材人参同科同属,也是可用于保健食品的药材。随着其人工栽培的成功,每年都产生成千上万吨的三七茎叶废弃物,既占用了土地又污染了环境。此外,三七茎叶废弃物传统的转化方法主要是酸水解法,从原料制备到反应的过程中均向环境中排放了大量的有机溶剂及废酸碱,对环境造成很大程度的污染。因此,本研究采用环境友好技术——酶技术,并结合固定化技术进行了三七茎叶废弃物中有用物质的转化研究。
本研究选择PVA-硼酸法和海藻酸钙法两种包埋方法首次对β-葡聚糖苷酶(β-glucanase)进行了固定化研究。在操作简单、颗粒易成型、机械强度较好的前提下,以温度和pH作为评价指标,初步确定了PVA-硼酸法和海藻酸钙法的配方。PVA-硼酸法的胶凝剂配方为:PVA:海藻酸钠:活性炭:水=7:1.5:4:100(w/w/w/v),交联剂配方为:饱和硼酸+2%的氯化钙溶液;海藻酸钙包埋法的胶凝剂配方为:海藻酸钠:水=3:100(w/v),交联剂配方为:7%的CaCl<,2>溶液。
对PVA-硼酸法固定化β-葡聚糖苷酶转化三七叶总皂苷进行研究,发现PVA-硼酸法中活性炭的有无对转化产物——抗肿瘤活性成分人参皂苷Compound K(简称C-K)的产量有很大的影响,因此胶凝剂配方进一步优化为PVA:海藻酸钠:水=7:1.5:100(w/w/v)。并对PVA-硼酸法反应工艺进行优化,得到最佳反应条件如下:最佳反应时间为48h;最佳反应温度为57℃;最佳反应pH为pH=6~7。
对海藻酸钙包埋法固定化β-葡聚糖苷酶转化三七叶总皂苷进行研究,优化固定化参数得到:最佳包酶浓度为10%(v/v),最佳交联时间为4~6h,交联剂最佳浓度为6~7%;优化固定化反应工艺得到:最佳反应时间为48h,最佳反应温度为53℃,最佳反应pH为pH=6,最佳底物浓度为20mg/mL。
此外,还进一步研究了超声、有机溶剂以及金属离子激活剂等对固定化酶活性的影响。结果发现:超声对固定化酶活性几乎无促进作用:不同浓度乙醇对海藻酸钙法固定化酶的影响结果表明:乙醇浓度为3%左右时游离酶活性最高,当乙醇浓度大于5%时游离酶活性随着乙醇浓度的增加而迅速降低;而固定化酶活性则在乙醇浓度为5%左右时达到最高,高于游离酶活性最佳时的乙醇浓度(3%),并且固定化酶活性始终比较稳定,说明固定化酶对乙醇等有机溶剂毒性的耐受力较游离酶强。金属离子对固定化酶活性激活作用实验表明:Ca<2+>离子对酶活性的激活作用最好,且始终为激活剂;Mg<2+>离子和Co<2+>离子次之,均在低离子浓度时促进酶活性而高离子浓度时抑制酶活性;Fe<3+>离子对固定化酶活性不但没有促进作用,反而有明显的抑制作用。其次,无论哪种离子激活剂,都是在低离子浓度时对酶活性促进效果好:Ca<2+>离子最佳浓度为5×10<-3>mol/L,Mg<2+>离子最佳浓度为5~10×10<-3>mool/L,Co<2+>离子最佳浓度为5~10×10<-3>mol/L。总之,β-葡聚糖苷酶经固定化后不仅可以重复使用,而且操作简单方便,抗有机物毒性能力、稳定性均有增加,有利于连续化生产的应用。对固定化技术进行深入研究并应用于天然活性成分领域,不仅可以解决制药行业带来的一系列环境污染问题,还可以提供一种新的天然药物制备方法,具有重要的环境、医学和经济价值。