肝细胞癌(简称“肝癌”)是世界上最常见的恶性肿瘤,是中国第二、全球第三的恶性肿瘤死亡原因。富血管作为肝癌的重要恶性特征之一,是肝癌侵袭与转移的基本条件。抗血管生成治疗可明显抑制肝癌进展和延长患者生存,目前已成为治疗晚期肝癌的主要治疗方式之一。但是,抗血管生成治疗的总体疗效依然欠佳。由于血管内皮细胞的表面受体如VEGFR和FGFR等作为抗血管生成药物的主要靶点在正常血管与组织细胞亦广泛表达,抗血管生成药物靶向作用缺乏针对肿瘤血管的特异性。这一方面影响了正常血管产生较多的副作用致使患者停药,另一方面造成了脱靶效应并可能促进肝癌的侵袭转移,这些效应都在一定程度上削弱了抗血管生成治疗的疗效。因此,研究肝癌血管内皮细胞的特征及功能,寻找标记血管内皮细胞的特异性指标,精确靶向肝癌血管内皮细胞,提高血管生成药物疗效,减少抗血管生成药物的副作用,已成为当前晚期肝癌治疗的主要研究方向之一。既往血管内皮细胞的研究主要是采用脐静脉内皮细胞(HUVEC)或体外长期传代的微血管内皮细胞(microvessel endothelial cell, MEC)或动物模型中的血管内皮细胞进行研究,不能体现肝癌患者本身肝癌血管内皮细胞的真实情况而有一定的局限性。本研究中,我们课题组通过建立免疫磁珠分选血管内皮细胞的技术平台,利用两种不同血管内皮细胞标记手段,分别在肝癌患者配对的肝癌组织与癌旁正常肝组织中分选出两种分子标记的肝癌血管内皮细胞(tumor-derived endothelial cells, TEC)及正常肝血管内皮细胞(normal endothelial cells, NEC)。为分析和比较不同表型的TEC及NEC的血管源性特征及功能,我们对TEC和NEC进行体外培养和传代,观察各自形态的差异,研究各自促血管生成的功能及对抗血管生成药物耐药性的差异。我们通过基因表达谱芯片技术筛选出TEC与NEC之间功能差异的关键基因。我们以肿瘤细胞(Tumor cells, TC,肿瘤组织中去除CD31阳性细胞后的细胞)和肝细胞(Notumor cells, NTC,肝组织中去除CD31阳性细胞后的细胞)的基因表达谱作为参照,通过生物信息学的聚类分析及体内外功能实验分析TEC的特征及来源,并探讨其发生的可能分子机制,从而为抗血管生成药物治疗提供新的理论机制及寻找到新的治疗靶点。在本研究中,我们发现：1.我们采用两种血管内皮细胞特异性标记物CD31和CD105作为分选标记物,获得同一患者组织中CD31+ TEC/NEC以及CD105+ TEC/NEC,并能在体外培养及传代。2.对TEC和NEC进行体外功能试验和对抗血管生成药物反应的比较,证实TEC和NEC存在差异的同时也发现CD31+ TEC与CD105+ TEC存在差异：CD105+ TEC为纤维条索状形态,CD31+ TEC为典型的鹅卵石样形态；与CD105+ TEC相比较,CD31+ TEC在小管形成能力、细胞增殖、凋亡以及对抗血管生成药物sorafenib的抵抗能力(增殖能力和抗凋亡能力)都显著强于CD105+TEC; CD31+ TEC对抗血管生成药物sorafenib作用之后,其表面受体VEGFR1和VEGFR2的表达变化要小于CD105+ TEC。由此可见,CD31+TEC对抗血管生成药物的抵抗能力显著强于CD105+ TEC。不同表型的肿瘤血管内皮细胞在细胞形态、细胞功能上具有差异同时对抗血管生成药物所导致的细胞增殖抑制和诱导凋亡的抵抗能力也存在差异,提示这可能是肿瘤对抗血管生成要为治疗疗效欠佳的一个原因。3.为求进一步探寻TEC与NEC在基因水平的差异以及TEC可能的来源,我们采用Affymetrix U133 Plus 2.0技术检测TEC和NEC,以及TC和NTC的全基因组(>10000个基因信号)表达谱信号,通过无监督的分层集群和多维分析以及维恩图解方法分析发现TEC特异的表达谱信号(即TEC与NEC的差异表达信号,即TEC相关基因),与TC特异的表达谱信号(即TC与NTC的差异表达信号,即TC相关基因)存在很大程度上的重叠,而NEC与NTC却能明显区分开来,这提示NEC与NTC之间差异明显,但TEC与TC之间有很多的相似性。同时TEC与TC之间的差异要明显小于TC与NTC之间以及TEC与NEC之间的差异。由此可见,与NEC相比,TEC在表达谱水平上更相似于TC。据此,我们提出如下假说：TEC可能来源自TC即肿瘤细胞。4.进一步的体外实验和动物实验支持如上假说：1)原代TEC具有肝癌细胞的特异性标记物甲胎蛋白(AFP)的表达。2)TEC传代2-3代后,行染色体核型分析,发现5-20%的TEC为多倍体细胞,而100%NEC细胞为2倍体细胞,提示部分TEC具有肿瘤细胞的多倍体特性；3)将分选的TEC、NEC和TC细胞,接种NOD/SCID小鼠,可见TC和TEC均可形成肿瘤；TC和TEC形成的肿瘤与手术切除标本的肿瘤,在细胞形态学上相似；此外,在TEC成瘤的组织中,可见到大量人CD31阳性的细胞,部分细胞参与构建血管结构。4) 对肝癌细胞株HCC-LM3行qRT-PCR检测人CD31的表达,结果证实,与HUVEC相比较,HCC-LM3的人CD31表达量极低,二者存在明显统计学差异(p<0.001)；对人肝癌裸鼠移植瘤模型(HCC-LM3裸鼠移植瘤模型)收集的肝癌冰冻标本行免疫荧光双染人CD31和鼠CD31,发现肿瘤血管上有鼠CD31构建的血管的同时也有人CD31的染色的细胞参与构建的肿瘤血管,二者不存在交叉,进一步证实肝癌细胞有可能转变为CD31阳性肿瘤血管内皮细胞而参与血管构建。5)免疫荧光染色人肝癌组织冰冻标本,发现肿瘤血管壁上有部分细胞同时表达人CD31和AFP,提示肿瘤血管上同时具有内皮表型和肿瘤表型的细胞参与血管壁的构建,提示这部分细胞可能同时具有肿瘤和内皮的双重特性。5.从分选获得的匹配的原代细胞抽提DNA,并检测SNP,分析数据后发现,在染色体的拷贝数的变化上,TC变化最大,但同时也发现TEC和TC在拷贝数的变化上具有相似性,而且在8号染色体上的拷贝数的变化相对较多。后续会根据拷贝数变化探寻变化的基因进行进一步的分析研究。上述证据进一步证明在肝癌组织中的部分TEC来自于肿瘤细胞。结论：1.在形态上和功能上TEC与NEC有一定的不同。TEC具有更强的血管生成能力及对抗血管生成药物的抵抗。此外,CD31+ TEC在血管生成能力和对抗血管生成药物的抵抗能力方面也要明显强于CD105+ TEC。不同表型的TEC的存在及之间的差异可能是肝癌对抗血管生成药物治疗效果欠佳的一个重要原因2.通过基因表达谱水平检测、体外实验及动物实验证实部分肿瘤血管内皮细胞具有肿瘤细胞和血管内皮的双重特性,既能成管参与血管构建,又具有异倍体且能具有成瘤性：TEC的基因表达谱特征和染色体拷贝数的变化与对应的肿瘤细胞相似,这些均证实部分肿瘤血管内皮细胞来源自肝癌肿瘤细胞。这些结果提示TEC的异质性可能是现有的抗血管生成药物治疗肝癌疗效欠佳的一个重要原因。应用价值1.肝癌血管内皮细胞的异质性可能是抗血管生成药物治疗疗效不佳的一个重要原因,不同表型的肿瘤血管内皮细胞在血管生成、细胞功能及抗血管生成药物的反应的不同对揭示肝癌对抗血管生产药物治疗耐药提供了新的解释和机制,这对后续研究提供了新的研究方向。2.部分肝癌血管内皮可能来自于肝癌细胞,这可用于解释传统靶向VEGF受体的抗血管生成药物疗效不佳的现象。通过对TEC和NEC比较,寻找TEC特异的分子或探寻调节肿瘤细胞转化为TEC的关键机制,针对其中的关键机制进行干预,有望降低抗血管生成治疗的副作用并提高疗效。创新点1.本实验首次通过分选获得两种不同表型人肝癌血管内皮细胞进行研究,通过体外功能实验证实与CD105+ TEC相比较,CD31+ TEC具有更强的对抗血管生成药物的抵抗能力,这可能是对抗血管生成药物治疗肝癌疗效不佳的一种解释。而进一步的基因分析和后续实验的验证发现部分肝癌血管内皮细胞来源自肿瘤细胞则找到了肝癌血管内皮细胞的来源,丰富了抗血管生成药物治疗耐药的机制。2.基因表达谱和SNP研究分析发现TEC与肿瘤细胞更为相似,而不是与NEC相似,这提示TEC的来源可能主要是肿瘤细胞,而不是通过周围NEC的出芽增殖,这为肝癌领域抗血管生成治疗的设计提供了新的思路。3.基因表达谱分析筛选获得了肝癌血管内皮细胞与癌旁血管内皮细胞的差异基因,为进一步探索和寻找靶向基因进行抗血管生成药物的靶向治疗提供了基础。不足之处1.细胞分选技术方面：尽管我们已经对分选获得的细胞进行了功能验证,但免疫磁珠的分选方式不能完全排除其他非内皮细胞的污染,而且虽然CD31和CD105是最受认可的内皮细胞表面的特异性标志物,但亦不能排除存在CD31+或CD105+的其他非内皮细胞的可能。2.本研究对TC即肝癌组织中分选肿瘤血管内皮细胞过后的细胞统一归为肿瘤细胞,亦不能排除其他细胞的干扰。