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第一章自体骨髓基质细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究目的:将自体骨髓基质细胞(marrow stromal cells, MSCs)体外扩增后植入帕金森病(Parkinson disease, PD)大鼠的纹状体内,观察其在患鼠脑内的生存、分化、迁移等变化,以期为研究和治疗PD提供新的思路和新的方法。方法:将6-羟基多巴(6-OHDA)注入大鼠一侧黑质致密部(SNc)和中脑腹侧背盖区(VTA)内,建立PD样的动物模型。在PD大鼠胫骨处抽取骨髓后,从骨髓中分离出MSCs进行培养和扩增。在详细记录了每只PD大鼠的旋转次数后,用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, Brdu)标记扩增的MSCs,以细胞浓度为1×107/ml植入同种同体PD大鼠伤侧纹状体内。于术后7天、14天、21天、30天、60天腹腔注射阿朴吗啡(Apomorphine,APO)诱导PD大鼠的旋转行为,观察PD大鼠的行为学改变;取移植后存活7天、21天、2个月的PD大鼠的脑组织行Brdu免疫荧光和免疫组织化学单标检测,观察移植细胞的生存和迁移情况;行Brdu/胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和Brdu/神经原纤维(NF)抗体免疫组织化学双标检测,观察MSCs是否分化为星形胶质细胞和神经细胞。实验设立生理盐水替代细胞对照组和正常大鼠细胞移植对照组。结果:⑴PD大鼠模型的建立:PD大鼠模型恒定转向健侧,旋转次数>7r/min;H-E染色和TH免疫组化染色显示发现病鼠患侧SNc和VTA多巴胺能神经元的数目明显减少。⑵MSCs的分离、培养和标记:大鼠骨髓的MSCs体外培养两周后纯化,成梭形,平行排列或漩涡状生长。经细胞爬片Brdu免疫组化证实85%MSCs标记上Brdu。⑶MSCs脑内移植:脑切片Brdu免疫荧光加免疫组化染色结果显示移植初期,移植细胞呈簇状或串状沿针道分布,细胞数量较多,移植细胞向周围组织迁移,以移植区域为主。随着时间的推移,移植细胞逐渐向双侧纹状体、大脑皮层、海马、胼胝体、侧脑室、第三脑室等处迁移。⑷移植7天后,在许多Brdu+细胞的胞浆中可见到GFAP阳性产物,但是未观察到NF的阳性产物。⑸正常大鼠对照组移植细胞的存活、迁移、分化情况与PD组的结果相同,两组无统计学差异。⑹未移植PD模型组、MSCs移植组、生理盐水对照组的旋转实验显示,移植前后各组动物的旋转行为未见明显改善。⑺所有动物在移植两个月内未发现有肿瘤的形成。结论:在PD脑的微环境中,MSCs能向脑的许多部位进行迁移,并可分化为星形胶质细胞,MSCs用于PD细胞替代治疗有很大的可能性。但MSCs在PD脑的微环境中是否可以分化为神经细胞进而发挥功能改善PD的症状,尚有待于进一步研究。第二章:大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的实验研究目的:观察大鼠MSCs在维甲酸(Retinoic acid,RA)、RA联合胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)、与神经干细胞(neural stem cells, NSCs)共培养三种诱导条件下体外分化成神经细胞的能力,为其将来可能的临床应用提供理论和实验基础。方法:在大鼠胫骨处抽取骨髓后,从骨髓中分离出MSCs进行培养和扩增。取原代第五天的MSCs分别进行:A组:0.3ug/ml RA单独诱导MSCs;B组:0.3ug/ml RA联合20ng/ml GDNF诱导MSCs;C组:MSCs与已培养成球的NSCs共培养进行诱导,MSCs共培养之前行Brdu标记。诱导三天后免疫组织化学法检测各组贴壁细胞GFAP、NF、酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)表面标志的表达,以观察