研究背景:　　肺癌是当今世界上许多国家最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多基因、多阶段共同作用的过程。环境危险因素可以激活多种核转录因子进而参与调控下游基因的表达，从而引发肿瘤。激活蛋白-1（activated-protein1，AP-1）是一种参与细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤形成以及肿瘤转移的核转录因子，研究发现活化的AP-1可直接结合到靶基因启动子区的AP-1结合位点而调控肿瘤相关基因的表达，最终导致肿瘤的形成。AP-1是由Jun（c-Jun、JunB、JunD）和Fos（c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2）两大类蛋白家族组成的同源或异源二聚体复合物。目前已报道AP-1在包括肺癌在内的多种肿瘤中高表达，并且发现AP-1的主要成员c-Jun和c-Fos在肺癌组织中的高表达。前期研究发现c-Jun基因启动子区存在功能性遗传变异（-1318T>G、-673T>C）且能影响该基因的表达从而增加中国南方人群散发性结肠癌发病风险。因此，我们假设c-Jun、c-Fos基因启动子区的遗传变异与我国人群肺癌发病相关联。　　研究目的:　　探讨c-Jun、c-Fos基因启动子区的遗传变异与中国人群肺癌发病的关联，分析基因-基因以及基因-环境交互作用对肺癌发病的影响，并进一步通过功能实验揭示上述基因遗传变异与肺癌发病关联的分子生物学实质，为肺癌的预防、诊断、治疗提供科学依据。　　研究方法:　　本研究采用双中心病例-对照研究，在广州地区和苏州地区共收集1559例肺癌病例，并按性别相同、年龄相近成组配比的方式选取健康对照1679例；通过生物信息学分析筛选并选取c-Jun、c-Fos基因启动子区3个常见的多态位点[最低等位基因频率（minor allele frequency，MAF）>5％的称为常见多态位点]，包括c-Jun基因rs2760501（-1318T>G）、rs4646999（-673T>C）和c-Fos基因rs7101（-60C>T）；利用TaqMan法检测广州人群三个多态位点的基因型，并探索不同等位基因和基因型与肺癌的关联，继而在苏州地区收集503例肺癌和623例健康对照验证阳性位点与肺癌关联；采用Logistic回归分析不同等位基因，基因型及单体型与肺癌发病的关联，并应用相乘交互作用模型探讨基因-基因及基因-环境的交互作用对肺癌发病的影响；进一步通过qRT-PCR、Western Blot、萤光素酶报告基因试验深入研究上述基因的遗传变异的功能实质。　　研究结果:　　一、c-Jun和c-Fos基因多态性以及基因-环境的交互作用与肺癌发病的相关性　　在两个人群的对照组中，-1318T>G、-673T>C、-60C>T三个位点基因型频率分布都符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），这说明对照组符合随机人群分布的标准。广州人群研究显示，c-Jun基因的多态位点-1318T>G、-673T>C在肺癌病例和对照组中的分布差异有统计学意义（P<0.001，0.0014）。多因素非条件Logistic回归分析发现，校正年龄、性别、吸烟、饮酒、癌症家族史等混杂因素后，对于-1318T>G位点，以携带TT野生基因型个体为参照，TG基因型携带者发生肺癌的风险增加47%（校正OR＝1.47，95%CI＝1.22-1.77，P<0.001），GG携带者发生肺癌的危险性进一步增加到69%（校正OR＝1.69，95%CI＝1.12-2.57，P＝0.013），且肺癌发病风险与G变异等位基因的个数存在显著的剂量-效应关系（校正P趋势<0.001），按照赤池信息量准则（Akaikes information criterion，AIC），-1318T>G的遗传模型为显性遗传模型，进一步将变异基因型进行二分类合并，发现携带G变异基因型（-1318TG＋GG）个体可显著增加肺癌的发病风险（校正OR＝1.49，95%CI＝1.25-1.79，P<0.001）。对于-673T>C多态，以TT携带者为参照，携带CC纯合子个体发生肺癌的风险显著增加29%（校正OR＝1.29，95%CI＝1.02-1.64，P＝0.035），而CT杂合子携带者没有增加肺癌发病风险（P＝0.465），根据AIC准则，-673T>C符合隐性遗传模型，与-673T（TT+CT）基因型携带者相比，变异型CC基因型携带者发生肺癌的风险性显著增加了37%（OR＝1.37，95%CI＝1.14-1.64，P<0.001）。此外，c-Fos基因-60C>T多态的基因型和等位基因频率在肺癌组和对照组的分布皆无显著性差异（P值分别为0.263，0.190）。　　在苏州人群，我们对上述的阳性位点进行了验证，发现：与广州人群研究结果一致，多态位点-1318T>G、-673T>C皆可显著增加人群肺癌的发病风险，携带-1318G变异基因型（TG＋GG）个体发生肺癌的风险增加39%（校正OR＝1.39，95%CI＝1.08-1.77，P＝0.010），-673CC基因型携带者患肺癌风险增加32%（OR＝1.32，95%CI＝1.03-1.69，P＝0.032）。　　通过同质性检验发现广州人群、苏州人群与肺癌的关联具有同质性（-1318T>G：Breslow-Day检验P=0.776；-673T>C：Breslow-Day检验P=0.797），因此我们将两人群合并以提高统计效能并分析上述阳性位点与肺癌发病的关联。结果显示：携带-1318G变异基因型（TG＋GG）个体肺癌发病风险显著增加（校正OR＝1.46，95%CI＝1.26-1.69，P<0.001，Bonferroni adjust P<0.001）；-673CC基因型个体发生肺癌的风险性显著增加（校正OR＝1.35，95%CI＝1.17-1.56，P<0.001，Bonferroni adjust P<0.001）。　　连锁不平衡分析显示-1318T>G与-673T>C存在较弱的连锁特征(D’=0.184，r2=0.015)，因此我们进行了单体型（Haplotype）分析。结果发现，c-Jun基因两个多态位点构建的四个单体型-1318T-673T、-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G-673C在肺癌病例和对照间分布频率存在显著性差异（P<0.001）。Logstic回归分析显示，以携带-1318T-673T单体型个体为参照，携带-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G-673C单体型个体发生肺癌的风险皆显著增加（-1318T-673C：校正OR＝1.19，95%CI＝1.07-1.34，P＝0.0018；-1318G-673T：校正OR＝1.51，95%CI＝1.27-1.81，P<0.001；-1318G-673C：校正OR＝1.60，95%CI＝1.33-1.92，P<0.001）。进一步将c-Jun基因两个多态位点的危险基因型（-1318TG/GG和-673CC）进行组合（0，1，2），以携带0个危险基因型个体为参照，携带危险基因型个体发生肺癌的风险显著增加（1个危险基因型：校正OR＝1.52，95%CI＝1.31-1.77；2个危险基因型：校正OR＝1.97，95%CI＝1.55-2.50），且随着危险基因型的个数增加，肺癌发病风险也随之增加（P趋势<0.001）。　　此外，分层分析和交互作用分析发现吸烟和饮酒与危险基因型个数存在显著的基因-环境交互作用（P吸烟=0.009，P饮酒=0.007）。　　二、c-Jun基因启动子区遗传变异对c-Jun基因表达及启动子转录活性的影响　　为分析c-Jun基因型与表型（基因表达）间的关系，进一步在32例肺癌组织中检测c-Jun基因多态位点不同基因型对c-Jun mRNA、c-Jun蛋白表达的影响，结果显示：变异等位基因G（-1318GT/GG）携带者的c-Jun mRNA表达水平高于野生型携带者（P=0.002），-673CC携带者的c-Jun mRNA表达水平高于携带-673CT/TT基因型个体（P=0.003）；同样，比较危险基因型携带者和不携带危险基因型者c-Jun mRNA在肺癌组织中的表达水平，发现携带1个和2个危险基因型个体c-Jun mRNA表达水平高于不携带者（ANOVA检验P<0.001，线性回归P<0.001）；-1318GT/GG基因型携带者c-Jun蛋白的表达水平高于-1318TT携带者（P=0.038），-673CC携带者c-Jun蛋白的表达水平明显高于携带-673CT/TT个体（P=0.022）；同样，携带1个和2个危险基因型患者c-Jun蛋白的表达水平与携带0危险基因型个体的表达也是有差异的（ANOVA检验P=0.017，线性回归P=0.005）。　　为了在体外检测c-Jun基因多态位点-673T>C、-1318T>G对启动子转录活性的影响，本研究分别构建了仅含-673T>C多态两个等位基因的短片段启动子序列的报告基因质粒（p-673T和p-673C）以及包含-1318T>G，-673T>C两多态位点四种单体型的长片段启动子序列的报告基因质粒（p-G-C，p-G-T，p-T-C和p-T-T）。将上述质粒分别转染到人肺腺癌细胞系（A549）和人肺鳞癌细胞系（NCI-H520），检测不同质粒的转录活性的差异发现：p-673C的转录活性显著高于p-673T的转录活性高（PA549=0.011，PNCI-H520=0.006），同时还发现p-G-C，p-G-T，p-T-C的转录活性也高于p-T-T的转录活性（PA549<0.001，PNCI-H520<0.001），且以 p-G-C质粒的转录活性最高，表明-1318T>G，-673T>C两变异位点皆可提高c-Jun基因启动子的转录活性；此外，通过添加烟草提取物和乙醇乙醛混合物模拟实验发现，上述报告基因的转录活性较未添加组显著增加，且增加幅度以-1318G-673C单体型最大。这提示，烟草提取物、乙醇乙醛混合物可能会影响c-Jun基因启动子的转录能力。　　研究结论:　　（1）c-Jun基因启动子的多态位点-1318T>G、-673T>C能显著增加我国人群肺癌的发病风险。　　（2）-1318T>G、-673T>C多态位点构建的4种单体型，与携带单体型-1318T-673T个体相比较，-1318T-673C、-1318G-673T、-1318G-673C单体型携带者发生肺癌的风险显著增加。　　（3）将c-Jun基因两个多态位点-1318T>G、-673T>C的危险基因型进行组（0，1，2），以不携带危险基因型（0个）个体为参照，发现携带危险基因型个体显著增加肺癌发病风险，且随着危险基因型的个数增加，肺癌发病风险也随之增加。　　（4）吸烟、饮酒与危险基因型个数在增加肺癌的发病风险上存在交互作用。　　（5）c-Jun基因的多态位点-1318T>G、-673T>C与c-Jun基因表型存在显著的关联。在肺癌组织中携带-1318TG/GG个体c-Jun mRNA、c-Jun蛋白的表达均高于-1318TT携带者；-673CC携带者肺癌组织中c-Jun mRNA、c-Jun蛋白的表达也高于-673CT/TT携带者。　　（6）在A549、NCI-H520细胞株，烟草提取物（CSE）和乙醇乙醛混合物增加c-Jun基因启动子的转录活性，其中在含有两个变异等位基因质粒p-G-C的转录活性最高。　　总结以上我们推测：c-Jun基因启动子的遗传变异可能通过增强c-Jun基因转录活性，增加c-Jun基因的表达，从而增加肺癌发病风险。