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近年来,代谢组学在疾病早期诊断、药物靶点发现、疾病机理研究及疾病诊断等领域起到了关键作用。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后新兴发展起来的一种组学研究方法,是全面认识生物系统不可或缺的一部分,代谢组学研究对象为特定时间内所有低分子量(通常Mw<1500)代谢物的总和,关注的是整个代谢物组的变化,其关键是对目标体系内的所有代谢物进行定性和定量分析。代谢组学的研究对于人类健康、药物研发、食品领域、中医药研究、环境安全、代谢工程方面都有积极意义。本课题主要是针对靶向代谢组学的研究需求,开发了生物体代谢中的共性关键代谢通路中糖酵解过程代谢物以及三羧酸(TCA)循环中有机酸的检测方法。以大肠杆菌为例,对生物样本代谢物前处理方法及衍生化过程进行优化,利用气相色谱-串联三重四级杆质谱(Gas Chromatography-tandem triple quadruple Mass Spectrometry,GC-MS/MS)以及液相色谱-串联三重四级杆质谱(Liquid Chromatography-tandem triple quadruple Mass Spectrometry,LC-MS/MS)建立了对生物样本中多种代谢物的检测方法,并将其应用于癌细胞、植物组织等生物样本的检测中。本课题的主要工作如下:(1)本课题通过研究对比确定了大肠杆菌代谢物的高效提取方法和TCA循环中有机酸固相萃取的条件,建立了完整的大肠杆菌TCA循环中有机酸检测的前处理方法。在实验中分别尝试液氮冻融和超声破碎的方法进行细胞破壁及代谢物提取,通过对比代谢物的提取量发现液氮冻融的方法能准确提取细胞代谢物并保持其稳定性;随后利用固相萃取的方法对大肠杆菌提取液去除多余基质干扰,优化了固相萃取条件,使得目标化合物能够被有效提取而蛋白质等复杂基质能够被去除从而避免对质谱检测的干扰;通过衍生化试剂的选择、衍生时间温度的优化,使得6种有机酸均有较好的衍生化效率。所开发的前处理方法能高效的对细胞内目标检测物进行提取净化,该方法检出限低,重现性好适用于生物样本中代谢物的提取分离纯化。(2)针对六种有机酸衍生物开发了相应的气质联用检测方法。通过程序升温的设置完成了六种有机酸在气相色谱端的分离,通过母离子、子离子及碰撞电压的优化,建立多反应监测模式(MRM)的质谱条件,利用外标法定量并对检测方法进行了方法学验证。6种有机酸在20μg/L-1×104μg/L范围内线性良好,相关系数均大于0.99,加标回收率为82.3%-100.4%,相对标准偏差为2.3%-4.5%,方法检出限为2.0μg/L-18μg/L。该方法受基质影响小,重现性好,适合于复杂生物基质样本中有机酸含量的测定。(3)利用所建立的方法对癌细胞、植物组织中的有机酸含量进行了测定,样本中的6种有机酸均能够被检出。(4)在完整建立了大肠杆菌中有机酸检测方法后,又对大肠杆菌中糖酵解代谢物的检测分析进行研究。首先配置大肠杆菌标准品溶液,对糖酵解代谢物的LC-MS/MS方法进行摸索,确定了以乙腈和10 Mm/L乙酸铵为流动相,比例为9:1的洗脱条件,流速为300μL/min,进样体积为10μL。成功检测出磷酸二羟丙酮(PEP)、葡萄糖(Glu)、丙酮酸、葡萄糖-6-磷酸(G6P)/果糖-6-磷酸(F6P)、果糖-1,6-二磷酸(FBP),由于一些糖酵解代谢物如葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、3-磷酸甘油酸(3-PG)在尝试了很多种方法包括更换色谱柱,流动相的优化后在液相色谱上还是没有很好的分离,因此后期尝试使用GC-MS结合衍生化的方法进行分析检测。以MSTFA为衍生化试剂对糖酵解代谢物的标准品进行衍生后进样分析成功检测出这几种物质,在对实际样本大肠杆菌进行检测时成功检测出丙酮酸和葡萄糖。