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研究目的:高滴度抗β2GPI抗体(anti-β2-glycoprotein I antibody,anti-β2GPI Ab)是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)患者血清中的独立危险因素,增加了APS患者中血栓形成和反复流产的危险。抗β2GPI抗体能够诱导单核细胞、血管内皮细胞表达组织因子、粘附分子、肿瘤坏死因子等众多细胞因子,从而引发炎症、高凝等病理过程,参与APS的致病机制。本课题组前期研究表明,TLR4能够促进β2GPI刺激的小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)的活化和成熟;有利于β2GPI免疫小鼠引起Th细胞向Th2细胞分化。然而,对于TLR4在B细胞发挥的自身免疫反应和APS相关抗体产生过程中的作用仍需进一步的探究。本文在前期研究和相关文献报道的基础上,通过比较TLR4缺陷组(C3H/He J)小鼠和TLR4正常组(C3H/He N)小鼠经β2GPI免疫后抗体效价、B细胞活化相关指标以及相关炎症分子和脾脏生发中心等差异,探讨TLR4在β2GPI免疫小鼠脾脏B细胞活化中作用。研究方法:(1)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):用于检测经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)血清中的抗β2GPI抗体的效价。(2)HE染色:检测分别经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)脾脏生发中心的个数及大小的变化。(3)免疫组织化学:检测分别经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)脾脏生发中心CD40L的表达。(4)实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PC R,RT-q PCR):分别检测经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)脾脏B细胞中IL-6和IL-10在m RNA水平的表达。(5)为进一步探讨TLR4在小鼠脾脏组织BAFF表达中的作用,本研究分别用RT-q PCR和Western blot检测经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)脾脏组织中BAFF的表达(m RNA和蛋白水平)。(6)流式细胞术(Flow Cytometry,FCM):为探究TLR4在β2GPI免疫的B细胞活化中的作用,本研究采用流式细胞术检测经β2GPI、BSA和NS免疫的C3H/He N小鼠(TLR4表达正常)和C3H/He J小鼠(TLR4表达缺陷)脾脏B细胞中CD80、CD86、CD40及MHCII的表达。研究结果:(1)经β2GPI免疫后,C3H/He N小鼠和C3H/He J小鼠血清中均出现高效价的抗β2GPI抗体,C3H/He N小鼠的抗β2GPI抗体效价(>1:100,000)高于C3H/He J小鼠(1:100,000),并且每个稀释点的A值均高于C3H/He J小鼠。BSA免疫及NS处理组未见抗β2GPI抗体的产生。(2)经β2GPI刺激后的小鼠脾脏生发中心,较BSA刺激组和生理盐水组更大更多,并且C3H/He N小鼠的生发中心的数量和大小都高于C3H/He J小鼠。(3)β2GPI免疫的C3H/He N小鼠脾脏组织中,BAFF在m RNA和蛋白水平上的表达量均高于β2GPI免疫的C3H/He J小鼠。(4)β2GPI刺激的C3H/He N小鼠CD40和CD40L的表达明显增高,与相同处理的C3H/He J小鼠有显著差异(p<0.01,p<0.05)。(5)C3H/He N小鼠经β2GPI刺激后,C3H/He N小鼠脾脏B细胞(CD19+)中CD80、CD86和MHCII表达明显升高,与相同处理的C3H/He J小鼠有显著差异(p<0.05)。(6)在β2GPI诱导的C3H/He N小鼠模型中,与相同处理的C3H/He J小鼠相比,C3H/He N小鼠脾脏B细胞产生更多的炎症因子(IL-6和IL-10)。结论:(1)β2GPI免疫小鼠产生特异性抗β2GPI抗体:β2GPI免疫的小鼠B细胞活化各项指标均高于无关抗原蛋白(BSA)免疫的小鼠,并产生高效价的抗β2GPI抗体。(2)TLR4促进抗β2GPI抗体的产生:与C3H/He J小鼠相比,β2GPI免疫的C3H/He N小鼠产生更高效价的抗β2GPI抗体。(3)TLR4促进β2GPI诱导的小鼠B细胞活化:C3H/He N小鼠经β2GPI刺激后,脾脏生发中心的个数变多,面积变大;脾脏组织中BAFF的表达增强;B细胞共刺激分子(CD80,CD86,MHCII)和B细胞炎症因子(IL-6和IL-10)的表达上调,且均高于β2GPI免疫的C3H/He J小鼠。(4)TLR4及Breg细胞可作为APS防治的靶点:本研究结果表明,降低TLR4的表达或增强Breg细胞的应答,能够减少抗β2GPI抗体的产生,从而更好的防治APS。